Phytomedicine I 野棉花中發現抗耐藥白色念珠菌新組合：CP4 與熊果酸協同破解生物膜感染難題！(羅曉東-云南大學化學科學與工程學院)

2026年4月8日，云南大學化學科學與工程學院/藥用資源化學教育部重點實驗室羅曉東團隊聯合中國科學院昆明植物研究所等，在Phytomedicine（中科院1區，IF=8.3）在線發表題為 “Prosapogenin CP4 and ursolic acid from Eriocapitella rivularis inhibit fluconazole-resistant Candida albicans synergistically by regulating Ras/cAMP/PKA pathway” 的研究論文。

▼編者按:

該研究聚焦口腔念珠菌病中氟康唑耐藥白色念珠菌難以清除、生物膜屏障增強、現有抗真菌藥物選擇有限且易產生不良反應等關鍵難題，從傳統用于治療口腔真菌感染的藥用植物野棉花中，鑒定出主要抗真菌活性成分原皂苷 CP4，并進一步發現其可與熊果酸產生顯著協同抗真菌作用。研究表明，CP4 能夠破壞真菌細胞壁和質膜完整性，靶向麥角固醇并誘導膜通透性增加，同時導致線粒體功能失活和氧化應激；而 CP4 與熊果酸聯合后，可通過調控 Ras/cAMP/PKA 信號通路，抑制白色念珠菌菌絲形態轉化和生物膜形成。動物實驗進一步證明，該組合能夠顯著降低小鼠口腔及舌組織中的真菌負荷，減輕炎癥反應并減少菌絲定植，其療效與傳統抗真菌藥物制霉菌素相當或更優。該研究不僅揭示了野棉花抗真菌活性的物質基礎和作用機制，也為耐藥白色念珠菌感染及生物膜相關口腔念珠菌病提供了新的植物藥協同治療策略。

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【摘要】

背景：真菌性疾病影響全球超過十億人，是重要的公共衛生問題。口腔念珠菌病是一種常見的真菌感染，主要由白色念珠菌引起。野棉花是一種傳統藥用植物，常用于治療口腔真菌感染。

目的：本研究旨在從野棉花中鑒定具有較強抗真菌活性的化合物，并闡明其潛在作用機制。

方法：本研究采用活性追蹤分離結合網絡藥理學的方法，從野棉花中篩選抗白色念珠菌活性成分，并進一步通過代謝組學分析探索其可能調控的通路。采用肉湯微量稀釋法、棋盤法和時間殺菌實驗評價其抗真菌活性及協同作用；通過定量和生化分析評估其對生物膜的抑制作用；采用實時熒光定量 PCR 闡明分子機制；并利用小鼠口腔念珠菌病模型驗證其體內療效。

結果：原皂苷 CP4 可破壞真菌細胞壁，靶向麥角固醇并誘導質膜通透性增加，同時使線粒體功能失活并抑制菌絲生長。這些作用可能與其干擾 ABC 轉運蛋白、調節 cAMP 外排以及誘導代謝紊亂有關。原皂苷 CP4 與熊果酸對氟康唑耐藥白色念珠菌表現出協同抑制作用，且誘導耐藥性較低。該組合可調控 Ras/cAMP/PKA 信號通路相關基因，顯著抑制生物膜形成，并降低小鼠口腔組織中的真菌負荷、炎癥反應和真菌定植，其療效與制霉菌素相當或更優。

結論：本研究提出了一種基于野棉花中兩種三萜類化合物的協同植物藥策略，為口腔念珠菌病，尤其是生物膜相關感染，提供了一種具有前景的治療思路。

01

研究背景及科學問題

真菌感染影響全球超過十億人，并帶來嚴重的公共衛生挑戰。白色念珠菌是念珠菌病的主要病原體，而念珠菌病是成人和兒童人群中最常見的真菌感染。值得注意的是，由白色念珠菌引起的膿毒癥死亡率接近 40%，高于多種細菌病原體及其他真菌感染相關的死亡率。白色念珠菌形成生物膜的能力被認為是多數念珠菌病病例中的關鍵毒力因素，并顯著導致其對常規抗真菌藥物產生治療抵抗，尤其是在生物膜相關感染中更為明顯。

口腔念珠菌病通常由念珠菌屬引起，常累及舌部及其他口腔黏膜區域。制霉菌素被廣泛用于臨床治療口腔念珠菌病，但可能引起惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應。此外，隨著抗真菌耐藥性的出現，可用治療選擇仍然有限。來源于藥用植物的天然產物具有多樣的化學結構、作用機制和分子靶點，且與微生物之間不存在強烈的生態競爭關系，因此較不容易誘導抗菌耐藥性，代表了抗真菌藥物發現中的一種有前景策略。

野棉花主要分布于中國西南地區，傳統上常以草藥煎劑漱口，用于治療口瘡和癬病，這提示其可能具有抗真菌感染的潛在療效。既往研究表明，野棉花具有抗增殖、抗腫瘤和抗菌活性，但其抗真菌活性成分及作用機制仍大多尚未明確。因此，本研究采用活性追蹤分離與網絡藥理學相結合的綜合策略，并結合代謝組學分析以及系統的體外和體內驗證，從野棉花中鑒定抗真菌化合物，并闡明其潛在作用機制。

02

重要發現及亮點

CP4 是野棉花中的主要抗真菌成分，并與 UA 表現出協同作用

本研究從野棉花中分離得到六種已知三萜類化合物，并通過系統的文獻比對確定其結構，分別為原皂苷 CP4、齊墩果酸、齊墩果酮酸、熊果酸、白樺脂醇和白樺脂酸。采用 MIC 和 MFC 實驗評價這些化合物的抗真菌活性，其中 CP4 對氟康唑耐藥白色念珠菌表現出最強活性，MIC 為 16 μg/ml。值得注意的是，UA 可將 CP4 的 MIC 從 16 μg/ml 降低至 2 μg/ml，而 CP4 可將 UA 的 MIC 從 512 μg/ml 降低至 128 μg/ml。棋盤法實驗顯示二者具有協同抗真菌作用，FICI 為 0.375，證實其存在協同效應。時間殺菌實驗進一步支持了這一結果，顯示聯合處理組較單藥處理組可使真菌活力降低至少 2 log10 CFU/ml。時間生長曲線顯示，CP4 和 UA 均具有濃度依賴性的抗真菌活性。

在耐藥誘導實驗中，CP4 和 UA 在連續傳代 15 代過程中均保持穩定的 MIC 值，而制霉菌素的 MIC 增加了 32 倍，達到 64 μg/ml；氟康唑則在 5 代內表現出 16 倍 MIC 升高。利用 Leuk1 口腔上皮細胞進行的細胞毒性評價顯示，即使在較高濃度下，CP4 和 UA 的細胞毒性也較低。值得注意的是，CP4 與 UA 聯合似乎能夠減少口腔上皮細胞死亡，且在最高測試濃度下，CP4-UA 聯合處理組的細胞存活率仍高于 80%，說明增強抗真菌效力的協同作用并未導致細胞毒性增加。

圖1. 溪畔野棉花（Eriocapitella rivularis）的高效液相色譜圖及已鑒定植物化學成分。

圖 2. CP4 和 UA 的抗真菌活性。
A：來自野棉花的抗真菌化合物的分數抑菌濃度指數值。
B：CP4 與 UA 協同作用的熱圖。
C：時間殺菌曲線。
D：時間生長曲線。
E：連續傳代 15 代過程中 MIC 值的倍數變化。
F–H：CP4、UA 及 CP4-UA 聯合處理對口腔上皮細胞 Leuk1 細胞活力的影響。
CP4：原皂苷 CP4；UA：熊果酸；NYS：制霉菌素；FCZ：氟康唑。統計學顯著性采用單因素或雙因素方差分析，并結合 Tukey 事后檢驗進行判定。ns 表示差異無統計學意義；星號表示與對照組或 CP4/UA 組相比差異顯著；NS 表示差異無統計學意義；井號表示與 CP4-UA 聯合組或制霉菌素組相比差異顯著。每個符號代表一個獨立生物學重復，n = 3。

網絡藥理學預測 CP4 可影響真菌菌絲生長、細胞膜完整性和生物膜形成

網絡藥理學分析預測，CP4 可能影響白色念珠菌的菌絲形態發生、細胞膜完整性及生物膜形成。研究共鑒定出 100 個候選靶點，并按照功能機制進行分類，其中許多靶點定位于膜相關結構，包括 A 類 G 蛋白偶聯受體和跨膜受體。GO 細胞組分富集分析顯示，這些靶點主要定位于細胞質區域、核質區、質膜結構域和膜微區，這支持了 CP4 作用于細胞膜的假設。KEGG 通路富集分析的前 20 條通路顯示，3′-5′-環腺苷酸和 Ras-proximate-1 信號通路在白色念珠菌感染中具有重要作用。CP4-白色念珠菌和 CP4-UA-白色念珠菌復合物的蛋白質相互作用網絡顯示，Ece1 是菌絲形態發生和生物膜形成的關鍵介導因子，也是 CP4 單獨作用及 CP4-UA 聯合作用的重要靶點。

圖 3. 網絡藥理學分析。
A：潛在分子靶點分類。
B：細胞組分、分子功能和生物過程的 GO 富集分析。
C：KEGG 富集分析顯示前 20 條通路。
D：CP4-白色念珠菌和 CP4-UA-白色念珠菌復合物重疊靶點的維恩圖。
E：關鍵靶蛋白的蛋白質相互作用網絡。

代謝組學分析驗證

代謝組學分析進一步驗證了 CP4 的作用。正交偏最小二乘判別分析顯示，CP4 處理組與未處理真菌細胞之間存在明顯的代謝差異。前 50 個差異代謝物的熱圖分析顯示，CP4 處理后，與 ABC 轉運蛋白活性相關的 L-天冬氨酸和 L-組氨酸水平顯著升高。KEGG 富集分析提示，CP4 可能調控 ABC 轉運蛋白，而 ABC 轉運蛋白參與脂質輸入/輸出、生物膜形成以及 cAMP 外排。總體而言，CP4 處理顯著改變了 367 種代謝物，主要涉及脂質、氨基酸和碳水化合物代謝，說明 CP4 可誘導真菌細胞內代謝紊亂。

圖 4. CP4 處理白色念珠菌的代謝組學分析。
A：OPLS-DA 得分圖，顯示處理組與未處理組之間的分離。
B：前 50 個差異代謝物的熱圖。
C：KEGG 通路富集分析。
D：改變代謝物的 KEGG 通路分類與分布。
CK：未處理組；CP4：4 × MIC 原皂苷 CP4 處理組。

CP4 抑制菌絲、破壞細胞包膜并使線粒體失活

體外實驗驗證了上述預測。掃描電子顯微鏡圖像顯示，CP4 明顯抑制菌絲發育，并導致真菌細胞表面出現可見損傷。相比之下，UA 及 CP4-UA 聯合處理誘導形成類似假菌絲的結構，但對細胞膜的破壞較小。此外，菌絲抑制實驗顯示，CP4 可使白色念珠菌維持酵母樣形態，而 UA 和 CP4-UA 聯合處理可抑制菌絲生長，并在 12 小時內使細胞呈現類似假菌絲的形態。

真菌細胞包膜由細胞壁和質膜組成，被鑒定為 CP4 的作用靶點。外源添加麥角固醇或山梨醇后，CP4 的 MIC 增加了 128 倍，提示 CP4 可能破壞細胞壁，并與麥角固醇相互作用，在質膜上形成孔洞，從而損害細胞包膜。采用碘化丙啶進行的膜完整性實驗顯示，CP4 處理細胞的熒光顯著增強，說明膜通透性升高，且該作用強于制霉菌素。與此一致，CP4 處理 4 小時內，細胞內成分包括核苷酸和蛋白質的釋放顯著增加，進一步支持其膜破壞作用。Laurdan GP 測定顯示，其數值呈劑量依賴性升高，表明膜流動性降低，并可能導致細胞裂解。CP4 處理還以劑量依賴性方式顯著增加質膜去極化，并導致線粒體膜電位降低，這說明線粒體發生失活。此外，細胞內活性氧水平和丙二醛含量均顯著升高，提示 CP4 誘導了氧化應激。雖然 UA 單獨處理表現出中等程度的抗膜活性，但 CP4-UA 聯合處理與 CP4 單獨處理相比，并未顯著增強其膜抑制活性。

圖 5. CP4、UA 及其聯合處理對浮游狀態氟康唑耐藥白色念珠菌的影響。
A：掃描電子顯微鏡圖像，顯示 CP4、UA 或 CP4-UA 聯合處理 6 小時后的超微結構變化；比例尺為 10 μm。
B：CP4 對質膜完整性的影響。
C–D：細胞外核苷酸和蛋白質釋放變化，反映膜通透性的改變。
E：CP4 的 Laurdan 廣義極化值，反映膜流動性。
F：CP4 對質膜電位的影響。
G：CP4 對線粒體膜電位的影響。
H–I：細胞內活性氧和丙二醛水平，反映氧化損傷程度。
J：CP4、UA 和 CP4-UA 聯合處理對質膜完整性的影響。
K：CP4、UA 和 CP4-UA 聯合處理的 Laurdan GP 值。
L：CP4、UA 和 CP4-UA 聯合處理對質膜電位的影響。
M：CP4、UA 和 CP4-UA 聯合處理對線粒體膜電位的影響。
CP4：原皂苷 CP4；UA：熊果酸；NYS：制霉菌素。統計學顯著性采用單因素或雙因素方差分析，并結合 Tukey 事后檢驗進行判定。ns 表示差異無統計學意義；星號表示與對照組相比差異顯著；NS 表示差異無統計學意義；井號表示與制霉菌素組或 CP4-UA 聯合組相比差異顯著。每個符號代表一個獨立生物學重復，n = 3。

CP4 和 UA 協同破壞生物膜

CP4 與 UA 的聯合處理顯著擴大了生物膜內部孔隙，并破壞了菌絲之間的連接。定量分析顯示，在黏附階段和增殖階段，CP4-UA 聯合處理分別使生物膜形成減少 83.2% 和 75.1%。此外，細胞外基質分析顯示，細胞外基質中的總蛋白和總碳水化合物成分顯著下降。這些作用均優于 CP4 或 UA 單獨處理，也優于制霉菌素，說明該聯合用藥對生物膜具有高效的協同抑制作用。

圖 6. CP4-UA 聯合處理破壞白色念珠菌生物膜并調控 Ras/cAMP/PKA 通路相關基因。
A：掃描電子顯微鏡圖像，顯示經 CP4、UA 或 CP4-UA 聯合處理后的生物膜超微結構；比例尺為 100 μm。
B–C：CP4、UA、CP4-UA 聯合處理或制霉菌素處理后，在黏附階段和增殖階段的生物膜抑制率。
D–E：CP4、UA、CP4-UA 聯合處理和制霉菌素對細胞外基質兩種主要成分——總蛋白和總碳水化合物含量的影響。
F：細胞內 cAMP 定量。
G：Ras/cAMP/PKA 通路相關基因表達的 RT-qPCR 分析。
CP4：原皂苷 CP4；UA：熊果酸；NYS：制霉菌素。統計學顯著性采用單因素方差分析，并結合 Tukey 事后檢驗進行判定。星號表示與對照組相比差異顯著；NS 表示差異無統計學意義；井號表示與 CP4-UA 聯合組相比差異顯著。每個符號代表一個獨立生物學重復，n = 3。

CP4-UA 聯合處理降低細胞內 cAMP，并調節 Ras/cAMP/PKA 通路相關基因

cAMP 定量實驗顯示，CP4 使 cAMP 水平降低約 17 nM，相當于約 5.6 ng/ml；UA 僅使其輕微降低約 9 nM，相當于約 3.0 ng/ml；而 CP4-UA 聯合處理則使 cAMP 水平大幅降低 43 nM，相當于約 14.2 ng/ml。這表明聯合效應顯著強于單獨作用效應的數學相加。

RT-qPCR 分析顯示，CP4-UA 聯合處理顯著下調 Ras/cAMP/PKA 通路相關基因的表達。其中，RAS1、CYR1、TPK1、EFG1、FLO8、HYR1、HWP1 和 ALS3 分別下調約 3 倍、1.5 倍、4 倍、4 倍、4 倍、1.5 倍、1.5 倍和 1.5 倍；而 ECE1 上調約 1.25 倍。這些轉錄水平變化提示，CP4-UA 聯合處理可抑制白色念珠菌的生物膜形成以及酵母向菌絲的轉化。

CP4-UA 聯合處理在小鼠口腔念珠菌病模型中恢復效果與制霉菌素相當

本研究采用小鼠口腔念珠菌病模型評價 CP4-UA 聯合處理的體內抗真菌活性。與模型組相比，高劑量和中劑量聯合處理組顯著降低了口腔和舌組織中的真菌負荷，分別約降低 3 倍和 4 倍，其效果與制霉菌素相當。組織學分析顯示，H&E 染色結果表明，聯合處理組軟腭部位的炎癥反應明顯減輕。PAS 染色進一步顯示，聯合處理可減少菌絲定植。相比之下，未治療模型組表現出明顯的真菌殘留和廣泛的菌絲定植。軟腭組織中的病理改變比舌組織更為明顯，這可能是因為軟腭黏膜為非角化且更薄的黏膜層，因此相較于舌背角化上皮，更容易受到抗真菌藥物和念珠菌誘導刺激的影響。

圖 7. CP4-UA 聯合處理在小鼠口腔念珠菌病模型中的療效。
A：小鼠口腔念珠菌病模型示意圖。
B：每日口腔真菌負荷變化。
C：小鼠舌組織中的真菌負荷。
D：軟腭和舌組織的 H&E 染色，顯示炎癥情況：角質層、散在嗜堿性細胞、血管、淋巴細胞浸潤及鈣化；比例尺為 100 μm。
E：PAS 染色顯示真菌殘留和定植；比例尺為 100 μm。統計學顯著性采用單因素或雙因素方差分析，并結合 Tukey 事后檢驗進行判定。星號表示與模型組相比差異顯著；NS 表示差異無統計學意義；井號表示與制霉菌素組相比差異顯著。每個符號代表一個獨立生物學重復，n = 6。

圖 8. CP4 和 CP4-UA 聯合處理的擬議作用機制。
A：CP4 通過靶向細胞包膜對抗氟康唑耐藥白色念珠菌的機制。
B：CP4-UA 聯合處理通過調控 Ras/cAMP/PKA 通路，抑制菌絲形態發生和生物膜形成的機制。
CP4：原皂苷 CP4；UA：熊果酸。

【Citation】:Zu WB, Wang ZJ, Tang DM, et al. Prosapogenin CP4 and ursolic acid from Eriocapitella rivularis inhibit fluconazole-resistant Candida albicans synergistically by regulating Ras/cAMP/PKA pathway.Phytomedicine. Published online April 1,2026.

【貢獻】★★★★★

CP4 被鑒定為野棉花中對氟康唑耐藥白色念珠菌具有主要抗真菌活性的化合物。它通過靶向真菌細胞包膜發揮作用，并表現出較低的耐藥誘導潛力。盡管廣泛存在的植物化學成分 UA 單獨使用時抗真菌活性有限，但其與 CP4 在體外和體內均表現出強效協同作用，可破壞生物膜，其效果優于傳統抗真菌藥物制霉菌素。這些發現強調了野棉花中兩種成分的協同潛力，為治療真菌感染并降低耐藥風險提供了一種有前景的植物藥策略。

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