Cell Metabolism (1區，TOP，IF=30.9)｜雙靶點狙擊 ACLY/ACSS2，EVT0185 同時逆轉 MASH 脂肪變性與肝纖維化!

2026年1月6日，McMaster University Gregory R. Steinberg、Dongdong Wang 團隊聯合 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Scott L. Friedman 等，在Cell Metabolism（中科院生物學1區，TOP期刊，IF=30.9）發表題為“Dual inhibition of ACLY and ACSS2 by EVT0185 reduces steatosis, hepatic stellate cell activation, and fibrosis in mouse models of MASH”的研究論文。

該研究圍繞代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）中“脂肪變性—肝星狀細胞活化—肝纖維化”的病理鏈條展開，系統評價了雙重抑制 ACLY 和 ACSS2 的小分子化合物 EVT0185 對 MASH 及肝纖維化的干預作用。研究發現，EVT0185 不僅能夠降低血清和肝臟甘油三酯、改善胰島素抵抗和肝脂肪變性，還能在多種 MASH 小鼠模型中顯著減輕肝纖維化，并且這一抗纖維化作用并不完全依賴體重下降或脂肪變性改善。機制上，EVT0185 通過抑制乙酸經 ACSS2 參與乙酰輔酶A代謝及膽固醇合成，削弱 TGFβ1 誘導的肝星狀細胞活化、膠原生成和細胞增殖。空間轉錄組、單細胞 RNA 測序、人肝切片及原代人肝星狀細胞實驗進一步表明，ACLY/ACSS2 雙靶點干預能夠同時作用于肝細胞脂質代謝和肝星狀細胞纖維化程序，為 MASH 及代謝相關肝纖維化提供了一種兼具改善代謝、減少脂肪沉積和抗纖維化潛力的新型治療策略。

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【摘要】

代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）的特征是脂肪變性、炎癥以及由肝星狀細胞（HSC）活化驅動的纖維化。乙酰輔酶A是從頭脂肪生成（DNL）和膽固醇合成的核心底物，它既可由檸檬酸經ATP檸檬酸裂解酶（ACLY）生成，也可由乙酸經乙酰輔酶A合成酶2（ACSS2）生成。本文證明，ACLY和ACSS2的雙重抑制劑EVT0185能夠降低血清和肝臟甘油三酯、改善胰島素抵抗并減輕纖維化。EVT0185在體內和體外均可直接抑制HSC活化；空間轉錄組學和單細胞RNA測序顯示，經ACSS2介導的乙酸代謝以及膽固醇合成受到抑制，是產生該表型的關鍵驅動因素。EVT0185還可抑制人肝切片中的從頭脂肪生成，并阻斷TGFβ1誘導的原代人HSC活化。這些發現表明，通過同時抑制ACLY和ACSS2來靶向膽固醇與乙酸代謝，可能成為治療MASH和肝纖維化的一種有前景的治療策略。

01

研究背景及科學問題

肥胖、胰島素抵抗和血脂異常是代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）發生發展的主要危險因素。MASH是一種進展性肝病，可進一步導致肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌。MASH從脂肪變性進展為具有臨床意義的肝病，主要由肝星狀細胞（HSC）的活化推動。在健康肝臟中，HSC負責儲存維生素A并維持肝臟結構；但在代謝應激和炎癥環境下，HSC會轉分化為具有增殖能力的肌成纖維細胞樣細胞，分泌細胞外基質（ECM），從而推動纖維化。盡管近期已有靶向甲狀腺激素受體β（THRβ）的激動劑（如resmetirom）和靶向胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R）的激動劑（如semaglutide）獲批用于MASH治療，但與安慰劑對照相比，只有約四分之一患者在纖維化組織學表現上出現改善。這一結果可能反映出HSC并不表達THRβ和GLP-1R。因此，能夠同時靶向肝細胞脂肪變性和HSC活化的策略，可能使更廣泛的患者獲益。

MASH的一個典型特征是從頭脂肪生成（DNL）增強，即由胞質乙酰輔酶A合成脂肪酸。在這一通路中，乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FASN）生成棕櫚酸（16:0），隨后可被硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）進一步修飾，生成棕櫚油酸和油酸等單不飽和脂肪酸，并由二酰甘油酰基轉移酶2（DGAT2）整合進入甘油三酯。AMP活化蛋白激酶（AMPK）對ACC的磷酸化和抑制，或者對ACC、FASN、SCD1和DGAT2進行遺傳或藥理學抑制，均已被證明可在MASH臨床前模型中降低脂肪變性、炎癥和纖維化。DNL增加還會使HSC對促纖維化信號更加敏感；藥理學抑制DNL則可減少培養細胞中的HSC活化。然而，在晚期纖維化臨床前模型中的研究顯示，將ACC抑制劑與過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）激動劑或resmetirom聯合使用，并不能進一步降低纖維化。與此一致的是，2b期研究中將DGAT2抑制劑與ACC抑制劑聯合使用，雖然意在緩解ACC抑制所引起的血清甘油三酯升高，但并未帶來具有臨床意義的MASH和纖維化改善。這些數據表明，盡管DNL抑制劑在臨床前模型中可顯著降低脂肪變性，并能在培養細胞中減少HSC活化，但若要降低臨床人群中的纖維化，可能還需要靶向其他代謝程序。

除脂肪酸外，胞質乙酰輔酶A也是膽固醇合成的主要結構單元。乙酰輔酶A主要通過兩條途徑生成：一是由檸檬酸經ATP檸檬酸裂解酶（ACLY）生成；二是由乙酸經乙酰輔酶A合成酶2（ACSS2）生成。膽固醇升高與MASH纖維化發生密切相關，近期研究還發現，攜帶PNPLA3 I148M變異的人群膽固醇水平也更高。從機制上看，膽固醇可激活HSC，并增強HSC對TGFβ1的敏感性；這一效應可能通過肝細胞中轉錄調節因子TAZ/WWTR1被激活，進而促使印度刺猬因子（IHH）分泌并激活HSC來實現。在MASH患者中，ACLY和ACSS2表達均上調。在MASH小鼠模型中，肝細胞ACLY的遺傳性抑制對脂肪變性的影響并不一致：有研究顯示脂肪變性降低，也有研究顯示無影響，甚至出現升高。相比之下，在小鼠模型中使用bempedoic acid（BA）處理可降低MASH；該藥物抑制ACLY并激活小鼠肝細胞中含AMPKβ1的異源三聚體，而其作用并不依賴肝細胞ACLY活性。抑制肝細胞ACLY活性的一個典型現象，是ACSS2表達上升；ACSS2可清除乙酸以維持DNL所需乙酰輔酶A供應。這一點可能具有重要臨床意義，因為乙醇可轉化為乙酸，而MASH患者門靜脈中的乙醇水平顯著升高，提示單獨抑制ACLY在該臨床人群中可能效果有限。值得注意的是，近期有研究發現，在肝細胞中遺傳性刪除ACLY和ACSS2并不能降低小鼠脂肪變性，原因可能與PPARα活性和脂肪酸氧化下降有關。與之相反，在本文修訂期間發表的一項研究發現，使用AAV8驅動的短發夾RNA敲低肝細胞中的ACLY和ACSS2，可提高PPARα水平并降低小鼠脂肪變性和MASH。雖然這仍屬推測，但不同研究間相反的結果，可能源于完全遺傳抑制與shRNA介導的部分抑制之間存在不同反應。藥理學同時抑制肝細胞以及HSC中的ACLY和ACSS2會產生何種影響，目前尚不清楚。

EVT0185是一種新近描述的ACLY和ACSS2抑制劑，可抑制肝細胞DNL，并通過提高腫瘤免疫原性，在肝細胞癌臨床前模型中降低腫瘤負荷。EVT0185的抑制活性依賴于脂肪酰輔酶A合成酶SLC27A2將其轉化為EVT0185-CoA。EVT0185對血糖控制、血脂異常、MASH、肝纖維化和HSC活化的影響此前尚未得到闡明。在本研究中，我們發現EVT0185可抑制肝臟脂肪變性、MASH、胰島素抵抗和肝纖維化，并可在體內和體外直接抑制HSC活化。其對HSC活化的抑制作用并不依賴脂肪變性下降；在葡萄糖和乙酸存在時，該作用具有細胞自主性，并需要SLC27A2、ACLY和ACSS2參與，同時可被膽固醇前體甲羥戊酸內酯所阻斷。這些數據表明，乙酸、ACSS2和膽固醇在培養細胞中驅動HSC活化方面具有關鍵作用，也提示EVT0185對該通路的拮抗不僅能夠降低脂肪變性，還能有效減輕肝纖維化。

02

重要發現及亮點

EVT0185在室溫飼養的飲食誘導小鼠模型中改善胰島素敏感性并降低MASH，且不升高血漿甘油三酯（圖1，圖S1）

來自Taconic Biosciences的飲食誘導肥胖MASH（DIN-MASH）小鼠，從6周齡開始喂食高脂（40%熱量）、高果糖（20%熱量）和高膽固醇（2%熱量）飲食，即Gubra-Amylin NASH（GAN）飲食，持續20周。隨后根據體重、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平，將小鼠隨機分為兩組（圖S1A–S1C）。該模型已被證明能夠較好地模擬人類MASH的轉錄組特征。隨機分組后，小鼠每日經口灌胃給予載體或EVT0185，持續5周（圖1A）。與載體對照組相比，EVT0185處理可防止體重增加（圖S1D），降低口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）后的血糖水平（圖1B），并通過腹腔胰島素耐量試驗（ITT）顯示胰島素敏感性得到改善（圖1C）。這些葡萄糖耐量和胰島素敏感性的變化，早于兩組體重差異出現；體重差異僅在治療5周后達到顯著。與胰島素敏感性改善一致，終點時禁食4小時測得的血漿葡萄糖水平在兩組間無差異（圖1D），而EVT0185處理組的血漿胰島素水平（圖1E）和胰島素抵抗穩態模型評估（HOMA-IR）評分更低（圖1F）。為探究體重增加輕度下降的潛在機制，研究者在體重差異出現前（第3周）使用代謝籠評估能量平衡變化，發現與載體對照組相比，EVT0185不影響食物攝入（圖S1E）、能量消耗（圖S1F）或呼吸交換率（圖S1G），提示可能存在其他機制。

圖1. 在喂食GAN飲食并于室溫飼養的小鼠中，EVT0185改善胰島素敏感性、MASH和纖維化，且不升高血漿甘油三酯

（A）DIN-MASH研究設計（載體組 n = 9；EVT0185組 n = 10），使用BioRender繪制。
（B）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）中記錄的禁食血糖值及相對曲線下面積（AUC）。
（C）胰島素耐量試驗（ITT）中記錄的禁食血糖值及相對AUC。
（D–F）（D）禁食血漿葡萄糖、（E）胰島素、（F）計算得到的HOMA-IR。
（G–L）（G）血漿ALT、（H）AST、（I）FFA、（J）膽固醇、（K）甘油三酯、（L）酮體。
（M）代表性肝臟圖片。
（N）肝臟甘油三酯。
（O）代表性肝臟H&E染色圖像。比例尺：200 μm。
（P）組織學評分（脂肪變性、氣球樣變、炎癥和MASLD活動）。
（Q）代表性肝臟PSR染色圖像。比例尺：200 μm。
（R）3區竇周纖維化評分。
（S）PSR陽性面積百分比。
數據以均值±SEM表示。顯著性檢驗采用非配對t檢驗、Mann-Whitney檢驗（組織學評分），或雙因素ANOVA后接Sidak檢驗（OGTT、ITT）。n.s.表示不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

EVT0185降低了血漿ALT、AST、游離脂肪酸（FFA）和膽固醇，但不影響甘油三酯（圖1G–1K）。EVT0185使血漿酮體升高約4倍（圖1L）。EVT0185處理組小鼠的肝臟外觀看起來脂肪變性減少（圖1M），生化分析也證實肝臟甘油三酯降低（圖1N）。協方差分析顯示，EVT0185引起的甘油三酯下降與體重無關。對H&E染色肝組織切片進行組織學評分發現，與載體對照組相比，EVT0185處理組小鼠的脂肪變性、炎癥、氣球樣變和代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）活動評分（MAS）均降低（圖1O、1P）。對苦味酸天狼星紅（PSR）染色肝切片分析顯示，EVT0185處理組的竇周纖維化評分改善（圖1Q、1R），PSR陽性面積降低約50%（圖1S）。總體而言，這些數據表明，在喂食GAN飲食26周的小鼠中，EVT0185能夠降低胰島素抵抗、血漿膽固醇、MASH和纖維化，且不會升高血漿甘油三酯。

另一種快速建立MASH和肝纖維化的模型，是在1周內給小鼠喂食含60%高脂、1.25%膽固醇和0.5%膽酸的飲食，并在飲水中加入2%的2-羥丙基β-環糊精（HFCC + CDX飲食）。完成1周飲食干預后，小鼠被隨機分配至載體組或EVT0185組；另設一組普通飼料喂養小鼠并給予載體，作為健康對照（圖S1H）。與載體相比，EVT0185不改變體重，也不改變血漿ALT、AST或甘油三酯水平，但可降低血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、C反應蛋白（CRP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA），并升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）（表S1）。肝臟組織學評估顯示，與載體處理的HFCC + CDX小鼠相比，EVT0185降低了脂肪變性（圖S1J）、炎癥（圖S1K）和MASLD活動評分（圖S1L），并使這些指標降至與健康普通飼料對照組無顯著差異的水平。用于顯示膠原沉積的天狼星紅（SR）肝染色顯示，纖維化評分（圖S1N）和SR陽性面積（圖S1O）均下降。與載體對照組相比，EVT0185還降低了α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性面積；α-SMA是HSC活化的標志（圖S1P、S1Q）。EVT0185還降低肝臟FFA和膽固醇（圖S1R、S1S）。與組織學上炎癥和纖維化降低一致，EVT0185降低了全肝中若干炎癥標志物（Il1b、Ccl2、Il6、Nfkb1、Tlr4和Tnfα）以及纖維化標志物（Tgfβ1和Col1a1）的mRNA表達（圖S1T、S1U）。因此，在這一快速飲食誘導MASH模型中，EVT0185治療可降低肝脂肪變性、炎癥和纖維化，同時降低血漿LDL-C和CRP/SAA。

EVT0185在兩個熱中性MASH小鼠模型中降低MASH和胰島素抵抗（圖2）

將雄性小鼠飼養于熱中性環境（29°C），并喂食高脂（40%）、高果糖（20%）以及含生理相關水平膽固醇（0.01%）的MASH飲食，能夠模擬人類MASH的時間進程、病理學和轉錄組特征。該模型稱為熱中性MASH（TN-MASH）模型，不同于其他在室溫下飼養小鼠并通過高膽固醇飲食誘導肝細胞損傷的MASH模型，例如前述DIN-MASH模型（GAN飲食）或HFCC + CDX飲食模型。這一區別很重要，因為熱中性飼養可降低靜息能量消耗，并消除誘導纖維化時對高水平膳食膽固醇的需求；高膽固醇飲食會抑制膽固醇合成，而膽固醇合成通路在人類MASH中通常上調。研究者在TN-MASH小鼠中完成了兩項實驗。

在實驗1中，小鼠2周齡時注射二乙基亞硝胺（DEN）以促進腫瘤發生；10周齡時轉入熱中性環境并喂食高脂高果糖飲食，直至32周齡，隨后給予載體或EVT0185處理4周（圖2A）。EVT0185顯著降低了腫瘤負荷。載體組和EVT0185組體重無差異。EVT0185降低了血漿葡萄糖（圖2B）、胰島素（圖2C）和ALT（圖2D），并升高血漿酮體（圖2E）。對H&E染色肝切片進行組織學檢查發現，EVT0185降低了脂肪變性和氣球樣變（圖2F、2G），但不影響炎癥，最終使MASLD活動評分降低（圖2G）。EVT0185還降低了3區竇周纖維化（圖2H、2I）和PSR陽性面積（圖2J）。

圖2. EVT0185在兩個熱中性MASH小鼠模型中降低MASH和胰島素抵抗（A）TN-MASH研究設計（每組 n = 12），使用BioRender繪制。
（B–E）（B）血漿葡萄糖、（C）胰島素、（D）ALT、（E）酮體。
（F）代表性肝臟H&E染色和氣球樣變圖像（橙色箭頭）。比例尺：100 μm。
（G）組織學評分（脂肪變性、氣球樣變、炎癥和MASLD活動）。
（H）代表性肝臟PSR染色圖像。比例尺：200 μm。
（I）3區竇周纖維化評分。
（J）PSR陽性面積百分比定量。
（K）慢性TN-MASH研究設計（每組 n = 7），使用BioRender繪制。
（L–O）（L）血漿ALT、（M）膽固醇、（N）甘油三酯、（O）酮體。
（P）代表性肝臟H&E染色和氣球樣變圖像（橙色箭頭）。比例尺：100 μm。
（Q）組織學評分（脂肪變性、氣球樣變、炎癥和MASLD活動）。
（R）代表性PSR染色圖像。比例尺：200 μm。
（S）3區竇周纖維化評分。
（T）PSR陽性面積百分比定量。

數據以均值±SEM表示。顯著性檢驗采用非配對t檢驗或Mann-Whitney檢驗（組織學評分）。n.s.表示不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

在實驗2中，小鼠未注射DEN，但接受相同MASH飲食并在熱中性環境中飼養72周，形成慢性TN-MASH模型，隨后給予載體或EVT0185處理4周（圖2K）。EVT0185降低了腫瘤負荷。EVT0185不影響體重，但降低血漿ALT（圖2L）和膽固醇（圖2M），不影響血漿甘油三酯（圖2N），同時升高酮體（圖2O）。H&E染色肝切片組織學檢查顯示，EVT0185降低脂肪變性、氣球樣變、炎癥和MASLD活動評分（圖2P、2Q）。PSR染色分析顯示，EVT0185降低3區竇周纖維化（圖2R、2S）和PSR陽性面積（圖2T）。這些數據說明，在喂食高脂高果糖飲食并處于熱中性環境的小鼠中，EVT0185可降低血糖和血漿胰島素，并減輕肝脂肪變性和纖維化，且不會升高血漿甘油三酯。

EVT0185在FAT-MASH小鼠模型中逆轉纖維化并降低血清甘油三酯（圖3A–3G，圖S2）

FAT-MASH模型從6周齡開始給雄性C57BL/6J小鼠喂食高脂（40%）和高膽固醇（2%）飲食（西方飲食），并在飲水中加入葡萄糖和果糖（糖水），同時每周腹腔注射低劑量四氯化碳（CCl4）。該處理可誘導明顯的肝脂肪變性、炎癥和纖維化，并具有許多人類MASH的病理學和轉錄組特征。隨后，小鼠在繼續維持西方飲食并接受CCl4注射的同時，給予載體或EVT0185處理11周（圖3A）。與載體對照組相比，EVT0185不影響體重、肝臟或脾臟重量、血清ALT或膽固醇（表S2）。EVT0185降低了肝臟和血清甘油三酯（圖3B、3C）。H&E染色肝切片的組織學分析顯示，EVT0185降低脂肪變性、氣球樣變和炎癥評分，從而使MASLD活動評分整體下降約4分（圖3D、3E）。關鍵的是，與載體相比，EVT0185使PSR陽性面積降低超過50%；與治療開始前（基線）觀察到的纖維化水平相比，降低了38%（圖3F、3G）。羥脯氨酸是膠原的重要組成部分，可作為膠原沉積和纖維化的指標；與載體相比，EVT0185也降低了羥脯氨酸水平（圖S2A）。這些數據表明，在FAT-MASH模型中，EVT0185可逆轉MASH和纖維化，并同時降低血清甘油三酯。

圖3. EVT0185在FAT-MASH和CCl4處理小鼠中降低纖維化，該作用不依賴脂肪變性降低

（A）FAT-MASH研究設計（基線 n = 5，載體組 n = 10，EVT0185組 n = 10，除非另有說明），使用BioRender繪制。
（B）肝臟甘油三酯。
（C）血清甘油三酯。
（D）代表性肝臟H&E染色圖像。比例尺：200 μm。
（E）組織學評分（脂肪變性、氣球樣變、炎癥和MASLD活動）。
（F）代表性肝臟PSR染色圖像。比例尺：400 μm。
（G）PSR陽性面積定量。
（H）尿檸檬酸/肌酐比值（載體組 n = 5，EVT0185組 n = 5）。
（I）CCl4-普通飼料研究設計（每組 n = 4–10），使用BioRender繪制。
（J）代表性肝臟PSR染色圖像。比例尺：200 μm。
（K）PSR陽性面積百分比定量。
（L）代表性肝臟α-SMA染色圖像。比例尺：200 μm。
（M）α-SMA陽性面積。
數據以均值±SEM表示。顯著性檢驗采用非配對t檢驗、Mann-Whitney檢驗（組織學評分），或單因素ANOVA后接Dunnett事后檢驗。n.s.表示不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

EVT0185增加尿檸檬酸（圖3H，圖S2B–S2C）

在上述MASH模型中，EVT0185同時降低了血漿葡萄糖和胰島素，以及循環和肝臟甘油三酯。這與ACC抑制劑的觀察結果形成鮮明對比：ACC抑制劑能夠降低肝臟甘油三酯，卻會升高血清甘油三酯。在DIN-MASH模型中，EVT0185降低體重增加，且該作用與食物攝入或能量消耗下降無關。那么，哪些機制可能介導這些效應？ACLY抑制會導致肝臟檸檬酸增加，而ACC抑制則會導致乙酰輔酶A增加。不同于乙酰輔酶A不能跨越許多細胞類型的細胞膜，檸檬酸可通過檸檬酸轉運蛋白由肝細胞和腎近端小管細胞分泌。因此，研究者推測，小鼠接受EVT0185處理后，檸檬酸可能被排入尿液。與這一假設一致，在長期接受EVT0185治療的FAT-MASH小鼠中，尿檸檬酸/肌酐比值較載體組升高（圖3H）。為進一步確認這一結果，研究者給喂食普通飼料的健康C57BL/6J小鼠給予EVT0185，并在首次給藥后24小時和6天測定尿檸檬酸/肌酐比值。治療24小時后，載體組與治療組無差異（圖S2B）；但治療6天后，EVT0185處理組的檸檬酸/肌酐比值高于載體組（圖S2C）。這些數據表明，EVT0185可增加小鼠尿液中的檸檬酸/肌酐比值，這一機制可能對防止血清甘油三酯升高具有潛在重要性。

EVT0185在無脂肪變性的小鼠模型中降低纖維化進展（圖3I–3M，圖S2）

為評估EVT0185是否能夠在不依賴脂肪變性降低的情況下直接抑制HSC活化，研究者在C57BL/6J小鼠中每周3次注射CCl4，持續3周，同時喂食普通飼料。這一方案已知可誘導HSC活化和增殖，但不會誘導脂肪變性。與此同時，小鼠每日經口灌胃給予載體、bempedoic acid（BA）或EVT0185。Semaglutide每兩周一次皮下注射，可單獨使用，也可與EVT0185聯合使用（圖3I）。EVT0185和BA均升高循環酮體（圖S2D）。與預期一致，H&E切片未顯示可檢測的脂肪變性（圖S2E）。與普通飼料對照小鼠相比，載體處理的CCl4小鼠PSR陽性面積增加（圖3J、3K）。BA和semaglutide對PSR陽性面積沒有影響，而EVT0185以及EVT0185聯合semaglutide均降低PSR陽性面積（圖3J、3K）。肝臟羥脯氨酸檢測（圖S2F）以及α-SMA染色切片分析（圖3L、3M）也得到類似結果。這些數據表明，EVT0185可在不依賴脂肪變性變化的情況下減緩纖維化進展，提示其可能對HSC具有直接作用。

EVT0185降低肝膽固醇酯、HSC數量及其活化狀態（圖4，圖S3，表S3–S6）

在多個不同MASH模型中證實EVT0185具有強效降低肝纖維化的有益作用后，研究者進一步探究介導這些作用的潛在機制。對EVT0185處理的TN-MASH小鼠肝臟進行生化分析發現，糖異生前體草酰乙酸以及脂肪酸氧化變構抑制劑丙二酰輔酶A均下降。這與血糖降低、酮體升高以及此前肝細胞特異性ACLY敲除小鼠中的觀察結果一致。此外，研究者還觀察到多種膽固醇酯（CEs）降低（表S3）。EVT0185對脂肪酸種類的影響更為復雜：部分脂肪酸下降，部分上升。具體而言，由SCD1介導棕櫚酸和硬脂酸去飽和而生成的棕櫚油酸（16:2）和亞油酸（18:2）均因EVT0185而升高。其他一些脂肪酸也呈現類似趨勢，例如α-亞麻酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，這些脂肪酸都是PPAR信號的強激活因子。

隨后，研究者對載體或EVT0185處理的TN-MASH小鼠肝臟中約770個已注釋的纖維化相關基因進行靶向分析。用于轉錄組分析的每組8只動物的MAS評分具有整個隊列代表性。與載體對照相比，EVT0185上調86個基因、下調170個基因（表S5）。通路圖顯示，與脂質種類變化一致，EVT0185主要上調PPARγ和脂肪酸氧化通路（圖S3A）。然而，在治療暴露窗口內，EVT0185體外報告基因實驗未顯示其對PPAR活性有直接影響（表S6），提示這些效應很可能是脂質代謝物變化的繼發結果。該分析中下調最明顯的通路包括膽固醇代謝、肌成纖維細胞調控、膠原合成和細胞因子信號，提示EVT0185可能直接作用于HSC。

為更精細地評估EVT0185對HSC的潛在直接作用，研究者對載體或EVT0185處理的FAT-MASH小鼠肝臟進行了空間轉錄組學分析（圖3A–3I）。利用Mmp7、Dcn、Igfbp7、Col3a1、Col1a1和Lum等HSC既定標志物，研究者在載體組和EVT0185組中識別出HSC群體（圖4A–4C）。研究者還觀察到一類肌成纖維細胞群體，該群體來源于駐留HSC的活化和增殖，并以Ltbp2、Mfap4、Lum、Cpxm2、Dcn、Col1a2、Col3a1、Dpt、Col1a1、Gpx3、Igfbp7和Gas6等ECM相關基因高表達為特征（圖4A–4C）。這些細胞的位置與其預期作用一致：肌成纖維細胞位于血管周圍，而HSC則彌散分布于整個肝臟（圖4D）。與纖維化減少一致，EVT0185降低了HSC和肌成纖維細胞的比例（圖4E），并降低HSC標志基因（Col1a1、Col1a2和Col3a1）以及肌成纖維細胞標志基因（Ltbp2、Mfap4、Lum、Col1a1、Col1a2和Col3a1）的表達（圖4F）。HSC和成纖維細胞的差異表達基因分析顯示，上調最明顯的通路為脂肪酸代謝過程（圖4G、4H）。進一步考察HSC和肌成纖維細胞中的脂肪酸分解代謝基因后發現，其基因表達特征與固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）及SREBP2靶基因升高一致（圖S3B、S3C）。此外，肉堿酰基轉移酶（Crat）和過氧化物酶體生物發生因子5（Pex5）也升高，這兩條通路對維持乙酰輔酶A至關重要。許多肝細胞群體中也觀察到類似變化（圖S3B、S3C）。這些數據表明，EVT0185可誘導一種與HSC活化和增殖標志物下降相關的基因特征。

圖4. 空間轉錄組學顯示EVT0185降低FAT-MASH小鼠中HSC數量和活化狀態

（A）聚類分析，顯示載體或EVT0185處理肝臟中的細胞類型數量。
（B）UMAP harmony整合分析，突出顯示HSC和成纖維細胞群體。
（C）標記HSC和成纖維細胞的基因特征。
（D）聚焦HSC和成纖維細胞的聚類分析，顯示EVT0185處理小鼠中HSC和成纖維細胞減少。
（E）HSC和成纖維細胞百分比。
（F）比較載體處理與EVT0185處理后HSC和成纖維細胞的基因特征。
（G）火山圖顯示EVT0185處理小鼠與載體處理小鼠HSC中的失調基因。
（H）基因-概念網絡圖，顯示基于EVT0185處理與載體處理小鼠HSC之間差異表達基因得到的相應基因本體（GO）術語。

EVT0185抑制HSC增殖通路并增強氧化代謝（圖5）

為進一步強化空間轉錄組學數據所得結論，研究者還對FAT-MASH小鼠肝臟進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）（圖3A–3I）。與空間轉錄組學分析一致，和載體處理小鼠相比，EVT0185處理小鼠中活化HSC（aHSC）的比例降低（圖5A）。scRNA-seq數據的降維分析顯示，在肝細胞和HSC中，載體組與EVT0185組之間存在清晰分離，說明EVT0185對這些細胞類型中的基因表達具有強烈影響（圖5B）。

圖5. FAT-MASH小鼠肝臟單細胞RNA測序分析顯示，EVT0185增加HSC和肝細胞中的氧化代謝與脂肪酸代謝

（A）EVT0185組與載體組FAT-MASH小鼠中活化HSC比例（每組 n = 3）。p值采用β-二項廣義線性模型計算，該模型以每個重復樣本中HSC數量占總細胞數量的比例進行建模。
（B）肝細胞和HSC的降維分析（UMAP）（EVT0185組與載體組）。
（C）肝細胞中Slc27a2、Acly和Acss2的平均基因表達。BH校正p值采用Wilcoxon秩和檢驗計算。
（D）aHSC中Slc27a2、Acly和Acss2的平均基因表達。p值采用Wilcoxon秩和檢驗計算。
（E、F）EVT0185組相較載體組，在aHSC（E）和肝細胞（F）中顯著富集的Hallmark基因集。
（G、H）aHSC（G）和肝細胞（H）中的SREBP1、SREBP2和PPARα靶基因。BH校正p值采用Wilcoxon秩和檢驗計算。

EVT0185可由SLC27A2轉化為輔酶A硫酯（EVT0185-CoA），這是其競爭性抑制ACLY和ACSS2活性的必要條件。與預期一致，來自載體處理FAT-MASH小鼠的肝細胞表達Slc27A2、Acly和Acss2（圖5C）。重要的是，aHSC中也觀察到類似表達；有趣的是，EVT0185處理后這些基因表達還進一步升高（圖5C、5D）。對aHSC進行基因集富集分析（GSEA）顯示，EVT0185正向富集氧化磷酸化、脂肪酸代謝、過氧化物酶體和膽固醇穩態等Hallmark基因集；同時負向富集細胞增殖相關基因集（Wnt/β-catenin、紡錘體和G2-M檢查點）、細胞周期與翻譯相關基因集（E2F靶基因）以及上皮-間質轉化基因集（圖5E）。在肝細胞中，脂肪酸代謝和膽固醇穩態方面也觀察到類似趨勢，同時TNFα信號負向富集（圖5F）。進一步分析這些基因集中的基因發現，在HSC（圖5G）和肝細胞（圖5H）中，許多經充分驗證的SREBP1和SREBP2靶基因上調，同時Cyp4a14和Cyp4a10（PPARα靶基因）以及Crat和Pex5顯著上調。這些數據表明，EVT0185可輕度增加SREBP靶基因；但與ACC抑制劑不同，EVT0185還可上調促進肝細胞和HSC氧化代謝的重要PPARα靶基因。

EVT0185抑制TGFβ1誘導的人源HSC活化（圖6，圖S4）

在證實EVT0185可在MASH小鼠模型中誘導與HSC抑制一致的轉錄特征后，研究者進一步測試這一作用是否可延伸至人類樣本。首先，研究者使用來自接受肝細胞癌腫瘤切除手術患者的非惡性組織，制備精準切割肝切片，并檢測EVT0185抑制DNL的效力。患者特征見表S7，肝臟病理顯示6名受試者中有4人在手術時存在脂肪變性。在載體處理下，DNL速率差異很大；但EVT0185處理使每一對患者肝切片樣本中的DNL均下降，平均降幅約33%（圖6A）。使用相同方法的既往研究已驗證該制備方式具有可行性，不過不同受試者之間的差異可能導致顯著變異。

圖6. EVT0185抑制DNL和TGFβ1誘導的原代人源HSC活化

（A）人肝切片經DMSO或EVT0185處理16小時后的從頭脂肪生成（n = 6）。p值采用配對t檢驗。
（B）UMAP圖顯示健康對照或MASLD個體肝臟中的HSC群體（每組 n = 2）。p值來自雙比例z檢驗。
（C）人HSC中SLC27A2的平均基因表達。BH校正p值采用Wilcoxon秩和檢驗計算（每組 n = 2）。
（D）代表性流式細胞術圖像，顯示在載體、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185處理后，原代人HSC中α-SMA抗體陽性細胞亞群。
（E、F）（E）α-SMA高表達/α-SMA低表達細胞群百分比，以及（F）載體、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185處理后的前膠原1A1生成（n = 3）。
（G、H）相對于載體對照，EVT0185處理的原代人HSC中放射性標記乙酸摻入固醇（G）或脂肪酸（H）的情況（每組 n = 3）。
數據以均值±SEM表示。顯著性檢驗采用單因素ANOVA后接Dunnett事后檢驗或非配對t檢驗。n.s.表示不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

為評估EVT0185在人源HSC中轉化為活性輔酶A硫酯的可能性，研究者分析了公開可用的單核RNA測序數據，比對健康對照和MASLD患者肝臟中的SLC27A2表達。該分析發現，MASLD患者肝臟中HSC比例更高（圖6B），且更重要的是，與健康對照相比，MASLD患者HSC中的SLC27A2表達更高（圖6C）。隨后，研究者在TGFβ1處理的原代人HSC中評估EVT0185作用。與載體對照相比，TGFβ1處理增加了α-SMA高表達細胞群相對于α-SMA低表達細胞群的比例（圖6D、6E）。重要的是，EVT0185在很大程度上阻斷了這種TGFβ1誘導的活化（圖6D、6E）。此外，與TGFβ1單獨處理相比，EVT0185處理的TGFβ1活化HSC中前膠原1A1生成減少（圖6F）。與全肝中膽固醇酯下降的觀察一致（表S3），EVT0185降低了由乙酸生成固醇的合成（圖6G），但不降低由乙酸生成脂肪酸的合成（圖6H）。由于巨噬細胞缺乏SLC27A2，EVT0185未能抑制培養的骨髓來源巨噬細胞（BMDM）中的炎癥標志物（圖S4A、S4B）。這些數據表明，EVT0185可抑制原代人肝切片和HSC中的DNL，并減少TGFβ1誘導的原代人HSC活化。

EVT0185通過依賴SLC27A2、ACLY和ACSS2的通路抑制HSC活化（圖7，圖S5）

為進一步研究EVT0185抑制HSC活化的機制，研究者需要使用一種易于進行基因編輯的系統。LX2細胞來源于人HSC，經SV40轉化，在TGFβ1處理后具有許多活化人HSC的轉錄特征。然而，與來自小鼠和人類的HSC不同，LX2細胞不表達SLC27A2（圖S5A），這一點與其他永生化細胞系一致。

為克服這一限制并評估EVT0185在LX2細胞中的作用，研究者構建了兩種細胞系：一種穩定表達空對照載體（PRP-empty），另一種表達人SLC27A2（PRP-SLC27A2）（圖7A）。利用這些細胞系，研究者在培養基中同時存在葡萄糖和乙酸（500 μM）的條件下，測試BA或EVT0185對TGFβ1誘導活化的影響。不同于此前在含葡萄糖但不含乙酸培養基中培養的原代HSC研究，無論是PRP-empty細胞還是PRP-SLC27A2細胞，BA處理均未抑制TGFβ1誘導的培養基中前膠原1A1分泌（圖S5B、S5C）。相反，EVT0185降低了PRP-SLC27A2細胞培養基中的前膠原1A1水平（圖7B），但對PRP-empty細胞無此作用（圖S5D）。在相同條件下進行的PrestoBlue細胞活力檢測顯示，細胞活力并未下降，說明EVT0185對前膠原1A1的影響源于活化減少，而非細胞死亡（圖S5E、S5F）。這些數據表明，EVT0185可在葡萄糖和乙酸同時存在時降低TGFβ1誘導的HSC活化，且這一作用依賴SLC27A2。

圖7. EVT0185通過依賴SLC27A2、ACLY和ACSS2的通路抑制HSC活化

（A）轉染對照質粒（PRP-empty）或表達SLC27A2質粒（PRP-SLC27A2）的LX2細胞中SLC27A2蛋白表達。
（B）在PRP-SLC27A2細胞中，與TGFβ1或TGFβ1 + 不同濃度EVT0185共同處理24小時后，相對于DMSO的人前膠原1A1水平（每組 n = 3）。
（C）WT、shACLY、shACSS2或shACLY + shACSS2敲低細胞在無TGFβ1（載體）或TGFβ1處理24小時后的人前膠原1A1水平（每組 n = 3）。
（D）表達WT或ACLY + ACSS2敲低的PRP-SLC27A2細胞，經載體、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185處理24小時后測得的人前膠原1A1水平（每組 n = 6）。
（E）PRP-SLC27A2 WT或ACLY + ACSS2敲低細胞經DMSO或EVT0185處理24小時后，放射性標記乙酸摻入固醇或脂肪酸的情況（每組 n = 3）。
（F）韋恩圖比較EVT0185相對于載體在PRP-empty或PRP-SLC27A2細胞中對差異富集Hallmark基因集的影響。
（G）PRP-SLC27A2表達細胞中差異富集Hallmark基因集的散點圖。
（H、I）PRP-SLC27A2表達細胞經載體、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185處理，并在培養基中加入乙酸或甲羥戊酸內酯后，培養基中的人前膠原1A1水平（H）和細胞增殖率（I）（每組 n = 3）。
數據以均值±SEM表示。顯著性檢驗采用單因素ANOVA后接Dunnett事后檢驗，以及雙因素ANOVA后接Tukey或Fisher最小顯著差異事后檢驗。n.s.表示不顯著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

與BA相比，EVT0185在乙酸和葡萄糖同時存在時效力更強，這使研究者提出假設：同時抑制ACLY和ACSS2可能對降低TGFβ1誘導的HSC活化很重要。為直接檢驗這一假設，研究者構建了可誘導短發夾RNA敲低ACLY（shACLY）、ACSS2（shACSS2）或二者同時敲低（shACLY + shACSS2）的LX2細胞（圖S5G），并在有或無TGFβ1條件下檢測膠原生成（圖7C）。與BA實驗觀察一致，無論培養基中是否存在乙酸，shACLY對膠原生成的影響都很有限（圖7C左側兩圖）。相反，shACSS2以及shACLY + shACSS2均顯著降低基礎狀態和TGFβ1刺激下的膠原生成（圖7C右側兩圖）；這一差異不能由細胞活力變化解釋，因為三種基因型中的細胞活力下降程度相近（圖S5H）。隨后，研究者評估EVT0185在異位表達SLC27A2并伴有shACLY + shACSS2的LX2細胞中抑制膠原生成和DNL的作用。結果顯示，雖然shACLY + shACSS2可降低膠原生成（圖7D）并抑制固醇和脂肪酸合成（圖7E），但EVT0185并未產生額外作用。這些數據表明，遺傳性抑制ACLY + ACSS2，或使用EVT0185進行藥理學抑制，均可阻斷LX2細胞中TGFβ1刺激的膠原生成和DNL。

為評估EVT0185抑制HSC活化的潛在機制，研究者對經TGFβ1刺激并與EVT0185共同處理24小時的LX2細胞（有或無SLC27A2）進行了RNA測序。與SLC27A2重要性的觀察一致，相較PRP-empty細胞，EVT0185處理PRP-SLC27A2細胞系后差異表達基因數量增加超過7倍（圖7F）。與體內空間轉錄組學和scRNA-seq結果類似，在EVT0185處理的PRP-SLC27A2細胞中，相較未處理細胞，脂肪酸代謝和氧化磷酸化Hallmark基因集最為富集。此外，研究者還檢測到Hedgehog信號以及G2-M檢查點/有絲分裂基因集受到抑制；這些基因集分別對HSC活化和增殖至關重要（圖7G）。值得注意的是，EVT0185處理LX2細胞后，膽固醇穩態和膽固醇合成基因集顯著升高，這與FAT-MASH模型中HSC的結果一致（圖4、圖5）。由于SREBP2靶基因和膽固醇合成/清除基因集大幅升高，而膽固醇對HSC增殖和活化又十分關鍵，因此研究者推測，補充膽固醇前體如甲羥戊酸內酯（100 μM），可能會阻斷EVT0185抑制TGFβ1誘導HSC活化的作用（圖S5I）。與這一假設一致，加入甲羥戊酸內酯后，EVT0185在PRP-SLC27A2細胞中降低24小時膠原合成（圖7H）和7天細胞增殖（圖7I）的作用被阻斷；但在PRP-empty細胞中沒有影響（圖S5J、S5K）。這些數據強烈提示，抑制膽固醇合成有助于EVT0185對HSC膠原生成和增殖的抑制作用。

【Citation】:Di Pastena F, Gautam J, Lally JSV, et al. Dual inhibition of ACLY and ACSS2 by EVT0185 reduces steatosis, hepatic stellate cell activation, and fibrosis in mouse models of MASH.Cell Metab.2026;38(1):33-49.e10.

【貢獻】★★★★★

本研究表明，EVT0185通過降低DNL并促進脂肪酸氧化來減輕脂肪變性。同時，研究識別出乙酸代謝是HSC活化的重要驅動因素，并顯示ACSS2對膽固醇合成和膠原生成至關重要。因此，ACSS2構成了抑制肝纖維化的一個核心脆弱環節，也使EVT0185區別于那些不作用于該軸線的其他DNL抑制劑。未來研究應在誘導型HSC特異性模型和人肝來源類器官中，結合同位素示蹤和空間代謝組學，進一步考察EVT0185和ACSS2的作用，以直接闡明這些通路在推動MASH和肝纖維化中的重要性。

研究局限性：雖然EVT0185已在多個互補性小鼠模型中得到檢驗，這些模型能夠復現人類MASH的關鍵組織學和轉錄組特征，但它們并不能完全反映人類疾病的慢性和異質性。雖然轉錄組數據和原代人HSC實驗支持EVT0185對星狀細胞活化具有直接作用，但仍需要在體內使用星狀細胞特異性刪除ACLY和ACSS2的方法來確認因果關系。最后，盡管研究結果強調乙酸代謝是星狀細胞活化和纖維發生的關鍵驅動因素，但本文并未在體內直接量化乙酸通量及其對乙酰輔酶A和膽固醇合成的貢獻。未來使用同位素示蹤和細胞特異性模型的研究，將有助于更細致地闡明這些機制。

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