NC | 美國埃默里大學梁波團隊首次揭示呼吸道合胞病毒RSV聚合酶早期RNA延伸過程中的核苷酸添加循環催化機制

2026年4月29日，美國埃默里大學梁波團隊在Nature Communications發表題為“Orchestrated and dynamic nucleotide addition cycle during respiratory syncytial virus early-stage elongation”的研究論文。該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術，捕捉了呼吸道合胞病毒聚合酶在早期RNA延伸過程中的多個關鍵構象狀態，系統揭示了RSV聚合酶在核苷酸添加循環中的動態構象變化與催化機制。研究還首次在NTP結合狀態和轉位后狀態中觀察到RSV聚合酶L蛋白全部五個結構域的結構，為理解單負鏈RNA病毒RNA合成機制，以及開發靶向病毒聚合酶的抗病毒藥物提供了重要結構基礎。

呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是一種高度傳染性的人類病原體。嬰幼兒、老年人、免疫功能受損人群以及心肺疾病患者均是RSV感染的高危人群。RSV屬于肺病毒科（Pneumoviridae）單負鏈RNA病毒，其基因組為單鏈負義RNA。RSV的RNA轉錄和復制由RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）催化完成。該聚合酶復合物由多功能聚合酶蛋白L（Large protein）和輔助因子磷蛋白P（Phosphoprotein）組成。其中，L蛋白包括五個結構域：RNA依賴性RNA聚合酶結構域（RdRp）、加帽結構域（Cap）、連接結構域（CD）、甲基轉移酶結構域（MT）和C末端結構域（CTD）。P蛋白則主要包括N端結構域（PNTD）、寡聚化結構域（POD）和C端結構域（PCTD）（圖1a）。

RSV的RNA合成過程包括起始、延伸和終止三個階段。在RNA延伸過程中，聚合酶通過不斷重復核苷酸添加循環，逐步延長新生RNA產物鏈。一個典型的核苷酸添加循環通常包括四個主要步驟：首先，新的核苷三磷酸進入聚合酶活性中心，并與模板RNA的+1位點堿基配對；隨后，活性位點閉合，使RNA模板、RNA產物、核苷酸、催化金屬離子和聚合酶處于適合催化的位置；接著，新的磷酸二酯鍵形成，并伴隨焦磷酸釋放；最后，RNA模板-產物雙鏈向前轉位一個堿基對，使+1位點重新空出，為下一輪核苷酸添加做好準備。

此前，梁波團隊已經解析了啟動子RNA結合狀態下的RSV聚合酶結構，揭示了RSV RNA合成起始階段的結構基礎。然而，在RNA延伸過程中，聚合酶如何招募新的核苷三磷酸、如何完成磷酸二酯鍵形成，以及如何推動RNA模板-產物雙鏈向前轉位，仍缺乏直接的結構證據。尤其是，RSV聚合酶L蛋白中的CD、MT和CTD結構域在以往解析的apo狀態和啟動子結合狀態中高度柔性，未能被解析，其在RNA合成過程中的結構狀態和功能作用仍不明確。

在本研究中，為捕捉RSV聚合酶在延伸過程中的不同構象狀態，作者設計了一種發夾狀RNA模擬物Tr3-mimic，以提高RNA模板與引物之間的配對效率（圖1b）。隨后，作者將RSV聚合酶分別與不同RNA底物、核苷酸或核苷酸類似物組裝，并通過冷凍電鏡解析了早期RNA延伸過程中的四種核苷酸添加循環關鍵狀態：NTP結合狀態、反應前狀態、轉位前狀態和轉位后狀態（圖1c）。其中，NTP結合狀態和轉位后狀態的結構顯示出L蛋白全部五個結構域；而反應前狀態和轉位前狀態與apo狀態及啟動子結合狀態相似，僅能解析L蛋白中的RdRp和Cap兩個結構域。

圖1：RSV聚合酶結構組成、Tr3-mimic RNA設計及早期RNA延伸過程中四種核苷酸添加循環關鍵狀態的轉換示意圖

將RSV聚合酶與TrC3-mimic和ApNpp在室溫下孵育后，作者獲得了分辨率為3.08 ?的NTP結合狀態冷凍電鏡結構。該結構包括L蛋白的五個結構域，以及P蛋白的POD和PCTD結構域（圖2a-b）。高分辨率冷凍電鏡密度圖顯示出清晰的RNA雙鏈、核苷酸類似物ApNpp，以及一個位于催化殘基D700、D811和ApNpp之間的鎂離子（圖2c）。結構分析顯示，RdRp和Cap結構域共同形成類似“碗狀”的催化核心，而在apo狀態和啟動子結合狀態下高度柔性的CD、MT和CTD結構域則位于該“碗狀”結構上方（圖2d）。CD-MT-CTD模塊與RdRp-Cap模塊之間的相互作用整體較弱，主要由supporting helix和supporting loops等局部結構元件介導（圖2e-h）。

圖2：RSV聚合酶NTP結合狀態結構，以及五結構域L蛋白中RdRp-Cap模塊與CD-MT-CTD模塊之間的相互作用

進一步比較apo狀態、啟動子結合狀態以及四種RNA延伸狀態后，作者發現RSV聚合酶在RNA合成過程中的構象變化可分為兩個層面。第一個層面是宏觀結構域重排，主要表現為與supporting helix和supporting loops相關的CD、MT和CTD結構域在不同狀態中的有序化和無序化。第二個層面是活性中心附近保守微觀motif的精細構象調整，包括motif A、motif C、motif D和motif F在不同催化狀態中的動態變化。

其中，supporting helix和supporting loops在不同狀態中呈現“開放”和“閉合”兩種構象，與CD-MT-CTD模塊的穩定性及構象變化密切相關。啟動子RNA結合可誘導motif F發生構象變化，其保守氨基酸殘基K619參與穩定+1位點的模板核苷酸。在apo狀態和啟動子結合狀態中，含有催化位點GDN的motif C呈伸展狀態，motif A也靠近催化位點；而在RNA延伸狀態中，motif C發生彎曲，motif A向外移動，從而為RNA產物鏈和新進入的核苷酸提供空間。同時，motif D中的K856在NTP結合狀態和反應前狀態中靠近核苷酸的三磷酸基團，而在催化完成后遠離活性中心。

這些結果表明，RSV聚合酶在RNA延伸過程中并不是簡單重復化學反應，而是通過多結構域、多保守motif、RNA底物、核苷酸和金屬離子之間的動態協同調控，連續完成RNA模板識別、核苷酸選擇、磷酸二酯鍵形成和RNA轉位等關鍵步驟。

綜上所述，該研究首次系統捕捉了RSV聚合酶在早期RNA延伸過程中的四個關鍵核苷酸添加循環狀態，揭示了RNA模板、RNA產物、核苷酸、鎂離子以及聚合酶保守motif之間的動態協同關系。該研究不僅補全了RSV聚合酶從RNA合成起始到早期延伸階段的重要結構圖景，也為理解單負鏈RNA病毒聚合酶的共性機制和病毒特異性調控提供了重要依據。由于RSV聚合酶是抗病毒藥物開發的重要靶點，這些結構發現也為開發靶向RSV及相關病毒聚合酶的廣譜抗病毒策略提供了新的結構基礎，相關病毒包括狂犬病毒、尼帕病毒和埃博拉病毒等。

文章通訊作者為梁波博士。梁波博士本科畢業于中國科學技術大學，博士畢業于佛羅里達州立大學，隨后在哈佛醫學院開展博士后研究，現為美國埃默里大學副教授。梁波實驗室主要結合冷凍電鏡、晶體學和生物化學方法，研究生物大分子的結構與功能機制，研究方向包括單負鏈RNA病毒RNA合成機制以及神經生物學疾病相關蛋白質的折疊機制。團隊目前正在招聘博士后，歡迎感興趣的學生聯系梁波實驗室(https://med.emory.edu/departments/biochemistry/research-labs/liang/index.html)；

文章第一作者為曹冬冬博士，現為美國埃默里大學梁波團隊副研究員。曹冬冬博士本科畢業于中國科學技術大學，并于中國科學技術大學獲得博士學位。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-72519-0