浙江
第一次做流式，最崩潰的不是上機，是上完機拿到那堆密密麻麻的散點圖。細胞碎片、死細胞、粘連體混在一起，根本分不清。導師丟下一句「你回去圈個門」，我對著屏幕愣了半天 —— 門在哪兒？
后來被師兄按著頭畫了十幾管樣本，才終于搞明白：圈門不是藝術創作，是一套固定到有點死板的排除邏輯。順序對了，誰畫都一樣。
今天就用人外周血分 T 細胞、B 細胞的真實流程，把每一步在電腦上怎么點、畫什么形狀、排除什么，完完整整走一遍。新手直接照著做就行：
先別急著畫門，看懂兩張圖
流式所有圈門，第一步全都要看 FSC 和 SSC。不用背原理，記住兩句話：
FSC：只看細胞大小，細胞個頭越大，數值越高；
SSC：只看細胞內部結構，細胞內部越復雜（顆粒多），數值越高。
例如：正常人外周血白細胞，在 FSC/SSC 散點圖上自然分成三堆，位置非常固定：
左下角：淋巴細胞（個頭小、結構簡單）
中間偏上：單核細胞（個頭中等、結構中等）
右上角：粒細胞（個頭最大、顆粒最多）
圖 1：外周血三群典型位置，記牢這個圖，后面所有操作都從這里出發
（源自騰訊網視頻）
做好對照，圈門才不會瞎畫
很多人結果不準、重復性差，不是因為不會畫門，而是沒調對照就上樣本。這三類對照，上機前必須調好，不然你圈出來的群可能是假的：
空白對照（未染色細胞）：定出陰性基線，分清「真信號」和「背景噪音」
同型對照：排除抗體非特異性結合，避免假陽性
單染管對照：調熒光補償，解決光譜重疊串色
圖 2：對照調好的樣子，陰性和陽性分得清清楚楚
（源于畢合生物）
六步圈門流程：在電腦上一步一步點出來
案例：人外周血，裂紅后染色（CD3-FITC 標記 T 細胞，CD19-APC 標記 B 細胞，7-AAD 死活染料）。
目標：統計樣本中 T 細胞、B 細胞的真實占比。
圖 3. 源自 BD Biosciences
第 1 步：先篩出完整、有效的細胞，剔除所有碎片
調取散點圖：FSC-A vs SSC-A。直接手動畫一個大多邊形門，把中間形態完整、輪廓正常的完整細胞全部圈進去。左下角零散、信號又弱又碎的小點，全是細胞碎片和雜質，直接排除，不要圈入門內。
圖 4：源自丁香園
第 2 步：去掉細胞粘連體（連體嬰）
調取散點圖：FSC-H vs FSC-A，只針對第一步圈好的細胞群單獨分析。正常單個細胞，信號面積和信號高度比例均勻，會整齊沿著對角線排布。兩個或多個細胞粘在一起的粘連體，會明顯偏離對角線。直接畫橢圓門圈住對角線整齊細胞群，門外全部粘連雜體直接剔除。
圖 5：源自菲恩生物
圖 6：源自賽爾普生物
第 3 步：精準篩出活細胞
調取散點圖：SSC-A vs 7-AAD 死活染料，僅對上一步合格單細胞分析。死細胞細胞膜破損，7-AAD 染料能鉆進細胞結合核酸，熒光信號會特別強；活細胞不會結合染料，熒光完全陰性。直接圈出 7-AAD 陰性細胞群，留下來的是高活性合格細胞。
圖 7：活細胞在陰性區，死細胞跑到右邊去了
（源自 Cell Signaling）
第 4 步（可選，但樣本雜質多時必做）：純化免疫細胞
調取散點圖 SSC-A vs CD45（白細胞通用標記）。直接圈出 CD45 陽性細胞群，把殘留的少量紅細胞、破碎雜質、非白細胞全部篩掉，后續分群背景會更干凈，數據更穩。
圖 8：CD45 陽性門內才是真正的白細胞
（源自廈泰生物）
如果你的樣本雜質多、背景臟，這一步能讓你后面的分群干凈一大截。
第 5 步：核心熒光分群，精準區分 T 細胞 vs B 細胞
調取散點圖：CD3-FITC vs CD19-APC，只在前面篩選好的活細胞里分析，直接用經典四象限門劃分亞群：
左上象限：CD3 陽性、CD19 陰性 —— 功能性 T 細胞。
右下象限：CD3 陰性、CD19 陽性 —— 功能性 B 細胞。
左下象限：雙陰性細胞，主要是單核細胞、NK 細胞等其他免疫細胞。
右上象限：雙陽性細胞，正常外周血里數量極少，基本可以忽略
圖 9：源自知乎
看到 T、B 清清楚楚分開在四個象限里，前面所有臟活累活就都值了。
第 6 步：導出數據，收工
圈門全部確認無誤后，直接讀取門內細胞占比，就能得到真實可用的實驗數據，這樣數據干凈、重復性高，后續復測誤差也很小。
圖 10：圈門確認無誤后直接讀比例
（源自于 Elanscience）
重復實驗小技巧：保存好門的位置，下次直接調用，不要憑感覺重新畫，否則誤差很大。
三條不廢話的實操原則（血淚總結）
1. 順序不能亂
碎片 → 單細胞 → 活細胞 → 亞群
每一步只在上一步合格的門內操作，不可逆、不許跳步。
2. 不看對照不畫門
基線、補償全部用對照管調好。門畫在陰性邊界上，不要憑肉眼主觀往右挪。挪一次，數據就不敢信了。
3. 門形跟著細胞群輪廓走
常規免疫細胞用多邊形或橢圓門，貼合細胞群邊緣。遇到稀有細胞或弱表達，切換密度圖或等高線圖，邊界看得更清楚，圈得更準。
這套思路還能用在哪？
你學會了上面這套分層排除法，不只是 T、B 細胞，絕大多數流式實驗都能直接套用：
免疫分型：CD4 / CD8 T 細胞亞群、Th1/Th2、單核細胞分群（CD14、CD16）
細胞凋亡：Annexin V / PI 雙染，區分活、早期凋亡、晚期凋亡、壞死
細胞周期：PI 染色，圈 G0/G1、S、G2/M
通用公式：圈出主細胞群 → 圈出單細胞 → 圈出活細胞 → 用特異標記圈出目標細胞
圖 11：整個圈門邏輯的總結圖，看一眼就記住
（源自知乎）
第一次畫門，你可能還是會手忙腳亂。沒關系，照著上面的六步，一步一個圖，畫完一遍之后，你會發現：
那些雜亂無章的散點圖，其實一直都有規律。
保存好你的門模板，下次做重復實驗，直接調用。
這樣出來的數據，你自己敢信，審稿人也挑不出毛病。
編輯：冷漠小 z
題圖：自制
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