Targetome I 雷公藤紅素“精準制動” CTSS，驅動 iNKT1 保護性極化，強力緩解膽汁淤積肝損傷 (王欣之/柳軍/邢孟韜-中國藥科大學)

膽汁淤積性肝損傷是一類由膽汁形成、分泌或排泄受阻引發的肝臟疾病，可伴隨膽汁酸蓄積、肝臟炎癥、肝細胞損傷，并進一步進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。當前臨床治療手段仍較有限，盡管熊去氧膽酸是常用一線藥物，但仍有相當比例患者應答不佳。因此，尋找新的治療靶點和干預策略，是膽汁淤積相關肝病研究中的重要方向。

近日，中國藥科大學王欣之、柳軍、邢孟韜團隊在Targetome在線發表題為 “Celastrol ameliorates cholestatic liver injury by promoting a protective iNKT1 polarization via CTSS inhibition and autophagy restoration” 的研究論文。

該研究聚焦：膽汁淤積性肝損傷中 iNKT 細胞亞群失衡及其免疫調控機制，圍繞天然產物雷公藤紅素如何通過靶向組織蛋白酶 S（CTSS）調節自噬/線粒體自噬、促進保護性 iNKT1 極化并緩解肝損傷和纖維化展開系統研究。

iNKT 細胞是連接先天免疫與適應性免疫的重要免疫細胞群，能夠快速產生 IFN-γ、IL-4、IL-17 等效應細胞因子，并在肝臟炎癥和免疫穩態中發揮關鍵作用。既往研究表明，致病性 iNKT17 細胞可參與膽汁淤積性肝損傷進展，而如何藥理性調控 iNKT 細胞亞群、將其從促炎損傷狀態轉向保護狀態，仍缺乏明確機制和有效策略。

本研究發現，雷公藤紅素可顯著減輕 EE 和 ANIT 誘導的膽汁淤積性肝損傷，降低血清 AST、ALT、ALP 等肝損傷指標，改善肝組織壞死、炎癥浸潤和假膽管樣增生，并恢復 FXR 及膽汁酸轉運、合成和代謝相關分子的表達，提示其具有改善膽汁酸穩態和緩解肝損傷的雙重作用。

進一步研究顯示，雷公藤紅素不僅作用于膽汁酸代謝通路，還顯著重塑肝臟免疫微環境。其可促進 iNKT 細胞由致病性 iNKT17 偏向轉變為保護性 iNKT1 偏向，表現為 IFN-γ^+ iNKT1 細胞比例升高、IL-17^+ iNKT17 細胞比例下降。體外 iNKT-肝細胞共培養實驗進一步證明，雷公藤紅素通過調節肝細胞與 iNKT 細胞之間的相互作用，降低肝細胞 Cd1d 和 Il12 表達，從而影響 CD1d 介導和 IL-12 介導的 iNKT 細胞激活過程。

在機制層面，研究團隊通過分選肝臟 iNKT 細胞并進行轉錄組分析，發現雷公藤紅素顯著影響吞噬體、溶酶體以及抗原加工與呈遞通路，其中 CTSS 被鑒定為關鍵樞紐靶點。膽汁淤積狀態下，CTSS 在 iNKT 細胞中顯著升高；而雷公藤紅素可下調 CTSS 表達，并通過直接結合 CTSS 抑制其功能。SPR 和分子對接實驗進一步支持雷公藤紅素與 CTSS 之間存在直接相互作用。

值得注意的是，CTSS 并非僅是一個伴隨變化的分子標志物，而是雷公藤紅素發揮作用的關鍵節點。CTSS 抑制劑 Z-FL-COCHO 可模擬雷公藤紅素的保護效應，減輕膽汁淤積性肝損傷、恢復膽汁酸穩態并促進自噬/線粒體自噬；而 CTSS 過表達則會削弱雷公藤紅素的保護作用。更關鍵的是，在 CTSS 敲除小鼠中，雷公藤紅素誘導 iNKT1 極化和肝保護的作用被消除，證明 CTSS 是雷公藤紅素發揮免疫調節和肝保護作用不可或缺的靶點。

該研究還揭示了 CTSS—自噬/線粒體自噬—iNKT1 極化 這一關鍵軸線。膽汁淤積狀態下，iNKT 細胞自噬和線粒體自噬受損；雷公藤紅素通過抑制 CTSS 恢復自噬流，降低 p62、提高 LC3II/I、Parkin 和 PINK1 等自噬/線粒體自噬標志物水平。使用氯喹阻斷溶酶體降解后，雷公藤紅素誘導的自噬恢復、iNKT1 極化和肝保護作用均被削弱，說明自噬恢復是其免疫重塑作用的必要環節。

此外，研究還將這一機制拓展至 CCl4 誘導的肝纖維化和急性肝損傷模型。結果顯示，雷公藤紅素同樣能夠抑制 CTSS、恢復自噬、促進 iNKT1 偏向，并減輕膠原沉積、降低纖維化標志物和改善肝損傷。該發現提示 CTSS-自噬-iNKT1 軸不僅參與膽汁淤積性肝損傷，也可能是肝纖維化及其他炎癥性肝病中的共性免疫調控機制。

臨床相關性方面，研究發現 ICP 患者 PBMC 中 CTSS mRNA 水平顯著升高，并結合公開單細胞測序數據發現，在膽汁淤積及肝纖維化相關模型中，NKT 細胞發生顯著改變且 CTSS 表達升高。這些結果增強了 CTSS 作為潛在臨床治療靶點的轉化價值。

總體而言，該研究提出了雷公藤紅素治療膽汁淤積性肝損傷的新機制：雷公藤紅素通過靶向抑制 CTSS，恢復 iNKT 細胞自噬/線粒體自噬，促進保護性 iNKT1 極化，同時改善肝細胞膽汁酸穩態和抗原呈遞功能，最終減輕膽汁淤積性肝損傷及纖維化進展。該工作不僅拓展了對膽汁淤積免疫病理機制的認識，也為以 CTSS 和 iNKT 細胞極化為核心的免疫干預策略提供了新的理論依據和潛在藥物開發方向。

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【摘要】

膽汁淤積性肝損傷涉及致病性恒定自然殺傷 T17（iNKT17）細胞擴增，目前治療手段有限。雷公藤紅素雖顯示出保肝潛力，但其在膽汁淤積和纖維化過程中調控 iNKT 細胞驅動病理變化的機制仍不清楚。本研究旨在闡明雷公藤紅素如何調控 iNKT 細胞極化，從而改善膽汁淤積性肝損傷及纖維化進展。

雷公藤紅素可減輕膽汁淤積性肝損傷和纖維化，并恢復膽汁酸穩態。它將肝臟 iNKT 細胞平衡從致病性 iNKT17 細胞轉向保護性 iNKT1 細胞。對分選的肝臟 iNKT 細胞進行轉錄組分析發現，組織蛋白酶 S（CTSS）是關鍵樞紐基因，將雷公藤紅素的作用與吞噬體/溶酶體通路聯系起來。雷公藤紅素可結合并抑制 CTSS，進而增強 iNKT 細胞中的自噬和線粒體自噬。

機制上，氯喹介導的溶酶體阻斷削弱了雷公藤紅素誘導的 p62 降解、自噬流、iNKT1 極化和肝保護作用。CTSS 抑制可模擬雷公藤紅素的獲益作用，而 CTSS 過表達則消除了這些作用。更關鍵的是，在 CTSS 敲除小鼠中，雷公藤紅素的肝保護作用和誘導 iNKT1 極化的作用均被消除，證實 CTSS 對雷公藤紅素發揮作用至關重要。

臨床相關性方面，妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）患者外周血單個核細胞（PBMC）中 CTSS mRNA 水平顯著升高。此外，利用 CD1d 缺陷小鼠，研究確定 iNKT 細胞是膽汁淤積中 CTSS 致病性上調的主要細胞來源。本研究揭示 CTSS 是膽汁淤積及其纖維化進展中的關鍵分子檢查點，其通過調控自噬/線粒體自噬來控制 iNKT 細胞極化，因此為膽汁淤積性肝損傷提供了新的治療靶點。

01

研究背景及科學問題

膽汁淤積性肝損傷是一類常見肝臟病變，其特征是膽汁形成、分泌和流動受損，并伴隨毒性膽汁酸蓄積、炎癥和肝臟損傷。若不能得到有效干預，可進展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。然而，膽汁淤積性肝損傷目前可用的治療選擇有限。熊去氧膽酸（UDCA）是推薦的一線藥物，可促進膽汁酸排泄，但多達 40% 的患者對其無應答。因此，迫切需要開發針對膽汁淤積性肝損傷的新治療靶點和藥物。

雷公藤紅素被《Cell》評為最具前景的天然產物之一，因其在多種適應證中具有廣泛藥理應用而受到高度關注。它具有強效的抗癌、抗炎、抗肥胖和保肝作用。在妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）大鼠中，雷公藤紅素可通過降低血清基質金屬蛋白酶 MMP-2 和 MMP-9 水平來緩解膽汁淤積。它還可通過激活沉默信息調節因子 1（SIRT1）和法尼醇 X 受體（FXR），并抑制核因子 κB（NF-κB）和 P53 信號通路，減輕 α-萘異硫氰酸酯（ANIT）和硫代乙酰胺（TAA）誘導的膽汁淤積性肝損傷。KEGG 通路分析進一步提示，雷公藤紅素可調節炎癥和膽汁酸穩態。

肝臟非實質細胞被發現可在膽汁淤積性肝損傷中發揮驅動和促進作用。單細胞測序和空間轉錄組分析顯示，膽道閉鎖患者肝臟中非實質細胞富集，包括巨噬細胞、自然殺傷 T（NKT）細胞、B 細胞和細胞毒性 T 細胞。耗竭 B 細胞或阻斷抗原呈遞可減輕肝損傷，提示靶向肝臟非實質細胞對膽汁淤積性肝病具有良好的治療潛力。

恒定 NKT（iNKT）細胞是一類特殊的先天免疫細胞亞群，兼具 T 細胞和自然殺傷（NK）細胞特征。它們可在抗原刺激激活后通過 T 細胞受體（TCR）依賴機制迅速產生效應分子，也可在細胞因子刺激下通過 TCR 非依賴機制發揮作用。類似于傳統 T 細胞，iNKT 細胞可根據其表達的效應分子分為不同功能亞群：分泌 IFN-γ 的 iNKT1、分泌 IL-4 的 iNKT2，以及分泌 IL-17 的 iNKT17。肝臟 iNKT 細胞，尤其是 iNKT17 細胞，會增加并參與膽汁淤積性肝病進展。

溶酶體蛋白酶組織蛋白酶在肝病的發生、發展和進展中具有重要作用。它們參與多種生物過程，如凋亡、自噬、肝星狀細胞（HSC）活化和炎癥。慢性肝病患者血漿中組織蛋白酶 B（CTSB）、L 和 D 水平與肝纖維化/肝硬化的發展呈正相關。組織蛋白酶參與復雜的信號級聯和網絡，如 B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、NF-κB 和 NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3（NLRP3）信號通路。CTSS 主要表達于免疫細胞中，其表達可被炎癥刺激誘導，并參與抗原呈遞和細胞內蛋白降解。CTSS 參與 iNKT 細胞的直接激活（CD1d 介導）和間接激活（IL-12 介導），也參與其效應功能，如 IFN-γ 分泌。然而，CTSS 如何通過調控 iNKT 細胞活性參與膽汁淤積仍不清楚。

雌激素是誘發膽汁淤積性肝損傷的重要危險因素，相關情況包括 ICP、口服避孕藥使用或絕經后激素治療。我們此前研究表明，iNKT17 細胞通過招募中性粒細胞和單核細胞放大肝臟炎癥，在炔雌醇（EE）誘導的膽汁淤積性肝損傷中發揮關鍵作用。此外，iNKT 細胞缺陷可緩解 ANIT 誘導的膽汁淤積性肝損傷。盡管已有這些發現，但膽汁淤積中調控 iNKT 細胞亞群的治療靶點和藥理策略仍缺乏深入認識，需要進一步探索。

本研究發現，雷公藤紅素通過抑制 CTSS 并增強 iNKT 細胞后續的自噬/線粒體自噬，在肝臟微環境中誘導保護性 iNKT1 偏向，從而減輕膽汁淤積性肝損傷和纖維化進展。iNKT 細胞是哺乳動物中進化上最保守的非常規 T 細胞亞群之一，提示其具有很大的臨床轉化潛力。本研究揭示了雷公藤紅素治療膽汁淤積的新藥理機制和治療靶點，為未來藥物開發提供了方向，并有助于合理設計膽汁淤積性肝損傷的預防和治療策略。

02

重要發現及亮點

雷公藤紅素減輕 EE 和 ANIT 誘導的膽汁淤積

我們采用已建立的 EE 和 ANIT 誘導膽汁淤積模型，評估雷公藤紅素的保護作用（圖 1a 和 f）。雷公藤紅素顯著改善膽汁淤積表型，降低肝臟/體重比以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平（圖 1b 和 g）。組織病理學檢查進一步證實，雷公藤紅素可減輕壞死（黑色箭頭）、炎癥細胞浸潤（紅色箭頭）和假膽管樣增生（黃色箭頭）（圖 1c 和 h）。

機制上，雷公藤紅素在轉錄和蛋白水平上均恢復了核受體 FXR 受抑制的表達（圖 1d、e、i 和 j）。它還糾正了膽汁酸穩態紊亂，逆轉了膽汁酸合成相關基因（Cyp7a1、Cyp27a1）、代謝相關基因（Cyp2b10）、攝取轉運體（有機陰離子轉運多肽 Oatp 和?；悄懰徕c共轉運多肽 Ntcp）以及替代外排轉運體（多藥耐藥相關蛋白 3，Mrp3）表達下降的情況，同時調節了經典外排泵膽鹽輸出泵（Bsep）表達升高（圖 1d 和 i）。雷公藤紅素還恢復了 CYP2B10 的蛋白水平（圖 1e 和 j）。

這些數據表明，雷公藤紅素可保護機體免受 EE 和 ANIT 誘導的膽汁淤積損傷。

圖 1｜雷公藤紅素保護機體免受 EE 和 ANIT 誘導的膽汁淤積。
（a）雷公藤紅素和 EE 的給藥方式。（b）、（g）肝臟/體重比，以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（c）、（h）肝臟 H&E 染色（200×，比例尺 = 50 μm；黑色箭頭：壞死；紅色箭頭：炎癥浸潤；黃色箭頭：假膽管樣增生；藍色箭頭：肝竇充血）。（d）、（i）膽汁酸穩態關鍵相關基因的 mRNA 表達。（e）、（j）FXR 和 CYP2B10 的蛋白水平。（f）雷公藤紅素和 ANIT 的給藥方式。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 EE 或 ANIT 組相比。

雷公藤紅素通過與肝細胞串擾促進保護性 iNKT1 極化

我們此前研究表明，iNKT17 細胞在 EE 誘導的膽汁淤積中發揮關鍵作用，而 iNKT 細胞缺陷可保護機體免受 ANIT 誘導的膽汁淤積損傷。因此，我們研究了雷公藤紅素對 iNKT 細胞的影響。CD3e^int CD1d-PBS57 tetramer^+ 被用作識別 iNKT 細胞的特異性標志物（圖 2a）。

與 EE 和 ANIT 誘導的膽汁淤積組相比，雷公藤紅素促進了 iNKT 細胞活化（CD69^+ iNKT 細胞），增加了 iNKT1 細胞（IFN-γ^+ iNKT 細胞）比例，并降低了 iNKT17 細胞（IL-17^+ iNKT 細胞）比例，使 iNKT17 亞型偏向轉變為 iNKT1 亞型偏向（圖 2b–e）。不同于傳統 Th1 和 Th2 細胞，iNKT1 細胞被認為具有保護作用，而 iNKT2 細胞可通過上調 FasL 和顆粒酶 B 表達誘導肝損傷。

體外實驗中，雷公藤紅素可在單獨培養條件下激活 DN32.D3 細胞，但不誘導亞型偏向（補充圖 S1a 和 S1b）。考慮到體內結果，我們采用兩種共培養模型來研究肝臟微環境中與 iNKT 細胞相互作用的細胞（圖 3b；補充圖 S1c）。在不影響細胞增殖的濃度下（圖 3a），iNKT-肝細胞共培養中，TCA 誘導的 AML12 細胞膽汁淤積性肝損傷在與 DN32.D3 細胞共培養后加重，而雷公藤紅素在 AML12 單獨培養和共培養系統中均減輕了肝毒性（圖 3c）。在共培養系統中，雷公藤紅素恢復了 TCA 處理導致下降的 CYP7A1、CYP8B1 和 FXR 蛋白水平（圖 3d）。雷公藤紅素還減輕了 EE 處理共培養系統中的肝損傷（圖 3h）。

與單獨 TCA 或 EE 處理相比，雷公藤紅素增加了 DN32.D3 細胞 IFN-γ 分泌，并減少 IL-4 和 IL-17 分泌（圖 3e 和 i），也提示 iNKT1 亞型偏向（圖 3f 和 j）。在共培養系統中的 AML12 細胞中，雷公藤紅素降低了 TCA 誘導的 Cd1d 和 Il12 mRNA 水平升高（圖 3g），提示雷公藤紅素通過肝細胞相互作用調節 iNKT 細胞的直接激活（CD1d 介導）和間接激活（IL-12 介導）。

盡管在不影響細胞增殖的濃度下，雷公藤紅素也可在 DN32.D3 與 RAW264.7 細胞共培養時激活 DN32.D3 細胞（補充圖 S1d），但與 LPS 組相比，它增加了 IL-4 和 IL-17 分泌，導致 iNKT17 偏向（補充圖 S1e 和 S1f）。

因此，雷公藤紅素優先通過與肝細胞相互作用誘導保護性 iNKT1 極化，從而發揮肝保護作用。

圖 2｜雷公藤紅素促進膽汁淤積肝臟中的 iNKT1 亞型偏向。
（a）iNKT 細胞（CD3e^int CD1d-PBS-57 tetramer^+）的門控策略。（b）、（d）CD69^+ iNKT 細胞、IFN-γ^+ iNKT1、IL-4^+ iNKT2 和 IL-17^+ iNKT17 細胞的比例及分析。（c）、（e）iNKT1/iNKT2 比值和 iNKT1/iNKT17 比值。數據以均值 ± SEM 表示，n = 4；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 EE 或 ANIT 組相比。

圖 3｜雷公藤紅素在 iNKT-肝細胞共培養中誘導 iNKT1 亞型偏向。
（a）AML12 細胞和 DN32.D3 細胞經雷公藤紅素處理后的 IC50 值。（b）AML12 細胞與 DN32.D3 細胞體外共培養方式，以及 TCA 和雷公藤紅素處理方式。在體外共培養系統中，（c）、（h）細胞上清液中的 AST 和 ALT 水平。（d）AML12 細胞中 CYP7A1、CYP8B1 和 FXR 的蛋白水平。（e）、（i）DN32.D3 細胞的活化情況（CD69）和細胞因子產生情況（IFN-γ、IL-4、IL-17）。（f）、（j）iNKT1/iNKT2 比值和 iNKT1/iNKT17 比值。（g）共培養系統中 AML12 細胞的 Cd1d 和 Il12 mRNA 水平。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.0001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.001，## < 0.0001，與 TCA 或 EE 組相比；ΔP < 0.05，ΔΔΔP < 0.001，與 AML12 細胞相比。

雷公藤紅素下調 CTSS 并促進 iNKT 細胞自噬/線粒體自噬

為鑒定雷公藤紅素的潛在靶點，我們利用流式細胞術從 ANIT 組以及 ANIT 聯合雷公藤紅素組中分選肝臟 iNKT 細胞（純度 > 99%）。轉錄組測序后，KEGG 分析顯示，雷公藤紅素顯著影響吞噬體、抗原加工與呈遞以及溶酶體通路（圖 4a）。蛋白互作網絡（PPI）分析表明，CTSS 是抗原加工與呈遞中的中心靶點（圖 4a）。

在體內和體外模型中，膽汁淤積均上調 CTSS 基因和蛋白水平，而雷公藤紅素下調 CTSS 表達（圖 4b 和 c）。更重要的是，ICP 患者 PBMC 中 CTSS mRNA 水平顯著高于健康孕婦（圖 4b）。吞噬體和溶酶體參與自噬過程。CTSS 對自噬相關降解和調控事件也至關重要，可維持細胞蛋白穩態和溶酶體功能。在膽汁淤積模型中，自噬標志物（p62 和 LC3II/I）以及線粒體自噬標志物（Parkin 和 PINK1）的表達均下降，而雷公藤紅素恢復了其表達（圖 4c）。

為表征雷公藤紅素與 CTSS 的直接相互作用，研究使用重組 CTSS 蛋白進行了表面等離子體共振（SPR）實驗。雷公藤紅素與 CTSS 具有結合親和力，平衡解離常數（KD）為 4.28 × 10^-5 mol·L^-1（圖 4d）。此外，利用 AutoDock Vina 進行分子對接分析，以預測雷公藤紅素與 CTSS 的潛在結合方式。預測結合能為 ?9.2 kcal·mol^-1，并發現雷公藤紅素與 CTSS 的 His164 之間存在氫鍵相互作用（圖 4d），提示其具有穩定而特異的結合構象。

我們進一步分析了公開 10× Genomics 單細胞測序數據集（GSE166178），并通過 UMAP 可視化膽管結扎（BDL）小鼠和對照小鼠肝臟非實質細胞中的九種不同細胞類型。結果顯示，BDL 小鼠與對照小鼠之間 NKT 細胞存在顯著差異。KEGG 分析顯示，NKT 細胞中的抗原加工與呈遞通路以及 IL-17 信號通路顯著上調（圖 4e）。在 BDL 小鼠中，CTSS 表達在 NKT 細胞中升高，但在肝細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）、內皮細胞或 NK 細胞中并未升高（圖 4e）。

此外，研究對膽汁淤積患者或小鼠肝臟與健康對照之間的差異表達基因（DEG）進行了 KEGG 富集分析。三個數據集的交集富集于八條通路，包括吞噬體通路（圖 4f）。GSE79850 的火山圖也顯示，膽汁淤積患者肝臟中 CTSS 表達升高（圖 4f）。上述結果提示，CTSS 是膽汁淤積性肝損傷的潛在病理靶點，也是雷公藤紅素的潛在藥理靶點。

圖 4｜雷公藤紅素下調 CTSS 并促進 iNKT 細胞中的自噬/線粒體自噬。
（a）流式分選肝臟 iNKT 細胞的結果、轉錄組測序差異表達基因（DEG）的 KEGG 富集通路分析，以及蛋白互作網絡（PPI）分析。（b）體內、體外及患者樣本中的 CTSS mRNA 水平。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，***P < 0.001，與對照組相比；# < 0.01，## < 0.001，與 EE、ANIT 或 TCA 組相比。（c）體內和體外 CTSS、p62、LC3I/II、Parkin 和 PINK1 的蛋白水平。（d）使用重組 CTSS 蛋白和雷公藤紅素進行 SPR 實驗獲得的平衡解離常數（KD）。通過雷公藤紅素與 CTSS 的分子對接預測結合區域和連接氨基酸（虛線表示 CTSS 與雷公藤紅素之間的氫鍵作用，距離為 3.1 ?）。（e）單細胞測序數據集 GSE166178 中 BDL 和對照小鼠肝臟非實質細胞的 UMAP 可視化、NKT 細胞上調 DEG 的 KEGG 分析，以及 CTSS 的細胞類型特異性表達。（f）三個數據集（膽汁淤積患者或小鼠肝臟與健康對照）的共享 KEGG 通路韋恩圖，以及 GSE79850 的火山圖。

CTSS 抑制通過恢復自噬減輕膽汁淤積性損傷

為首先證實 iNKT 細胞在驅動 CTSS 表達中的核心作用，我們使用了缺乏 NKT 細胞的 CD1d 缺陷（CD1d KO）小鼠。重要的是，膽汁淤積誘導的肝臟 Ctss mRNA 上調在 CD1d KO 小鼠中明顯消失（圖 5a），有力證明 iNKT 細胞是膽汁淤積微環境中 CTSS 的主要細胞來源。與野生型小鼠相比，CD1d KO 小鼠表現出顯著減輕的膽汁淤積性肝損傷，而雷公藤紅素在 CD1d KO 小鼠中的肝保護作用被消除，說明 NKT 細胞對于雷公藤紅素緩解膽汁淤積性肝毒性至關重要（圖 5b 和 c）。

在共培養系統中，CTSS 抑制劑 Z-FL-COCHO 減輕了 TCA 誘導的肝毒性，抑制 CTSS 上調，并促進自噬/線粒體自噬（圖 5d–g）。值得注意的是，DN32.D3 細胞中過表達 CTSS 消除了雷公藤紅素的獲益作用，包括降低 ALT/AST 釋放和恢復自噬/線粒體自噬（圖 5h–j）。通過 shRNA 敲低 DN32.D3 細胞中的 CTSS 表達也降低了細胞上清液中的 AST 和 ALT 水平，并抑制 DN32.D3 細胞中 p62 蛋白表達，說明遺傳性抑制 CTSS 同樣具有肝保護作用并可恢復自噬（圖 5k–m）。此外，通過氯喹（CQ）阻斷溶酶體降解后，雷公藤紅素的肝保護作用被消除，表明自噬恢復對雷公藤紅素的肝保護作用至關重要（圖 5n 和 o）。

為進一步驗證 CTSS 作為治療靶點的作用，我們在膽汁淤積模型中給予 CTSS 抑制劑 Z-FL-COCHO（圖 5p 和 u）。雷公藤紅素和 Z-FL-COCHO 均可改善膽汁淤積表型，降低肝臟/體重比以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平，并改善 EE 和 ANIT 誘導模型中的組織病理學改變（圖 5q、r、v 和 x）。機制上，Z-FL-COCHO 處理恢復了 FXR 表達和膽汁酸調控因子（Cyp7a1、Mrp3、Bsep 和 CYP2B10），抑制 CTSS 上調，并增強自噬/線粒體自噬（p62 降低，LC3II/I 和 PINK1 增加）（圖 5s、t 和 w）。更重要的是，CTSS 敲除后，雷公藤紅素的肝保護作用被消除（圖 5y）。這些結果證實，CTSS 是雷公藤紅素作用機制的核心，且抑制 CTSS 足以減輕膽汁淤積并恢復自噬流。

圖 5｜CTSS 抑制保護機體免受膽汁淤積性肝損傷。
（a）CD1d^-/- 小鼠中的 CTSS mRNA 表達，以及（b）血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（c）、（r）和（x）肝臟 H&E 染色（黑色箭頭：壞死；紅色箭頭：炎癥浸潤；藍色箭頭：肝竇充血）。（d）Z-FL-COCHO 處理 DN32.D3 和 AML12 細胞后的細胞活力。共培養系統中，（e）、（i）、（l）和（o）上清液 AST 和 ALT 水平。（f）DN32.D3 細胞中 Ctss 的 mRNA 表達。（g）DN32.D3 細胞中自噬/線粒體自噬標志物的蛋白水平。（h）DN32.D3 細胞中 CTSS 過表達。（j）CTSS 過表達 DN32.D3 細胞中的自噬/線粒體自噬標志物。（k）shRNA 介導敲低 CTSS 后，DN32.D3 細胞中 Ctss mRNA 表達。（m）、（n）shCTSS 表達或氯喹（CQ）處理 DN32.D3 細胞中 p62 的蛋白水平。（p）、（u）給藥方式。（q）肝臟/體重比，以及血清 AST、ALT 和 ALP 水平。（s）膽汁酸穩態相關關鍵基因的 mRNA 表達。（t）FXR、CYP2B10、CTSS、p62、LC3I/II 和 PINK1 的蛋白水平。（v）ANIT 誘導膽汁淤積中的肝臟/體重比及血清 ALT 水平。（w）CTSS 的 mRNA 和蛋白水平。（y）CTSS 敲除小鼠中的血清 AST 和 ALT 水平。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5–6；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 EE、ANIT、TCA 或 CEL 組相比。

CTSS 抑制促進 iNKT1 亞型極化

在 EE/ANIT 誘導的膽汁淤積中，Z-FL-COCHO 降低了肝臟 iNKT17 細胞比例，導致 iNKT1 亞型偏向（圖 6a–d）。在共培養系統中，與 TCA 組相比，雷公藤紅素和 Z-FL-COCHO 均增加了 DN32.D3 細胞 IFN-γ 分泌，并降低 IL-4 和 IL-17 分泌，提示其偏向 iNKT1 亞型（圖 6e 和 f）。此外，氯喹消除了雷公藤紅素誘導的 iNKT1 亞型偏向，說明自噬在雷公藤紅素誘導 iNKT1 細胞極化中發揮關鍵作用（圖 6g 和 h）。值得注意的是，CTSS 敲除使雷公藤紅素誘導的 iNKT1 細胞極化轉變為致病性 iNKT17 偏向（圖 6i 和 j）。因此，CTSS-自噬軸可在膽汁淤積肝臟微環境中誘導保護性 iNKT1 偏向。

圖 6｜CTSS 抑制促進 iNKT1 亞型偏向。
（a）、（c）、（e）、（g）和（i）活化 iNKT（CD69^+）細胞、IFN-γ^+ iNKT1、IL-4^+ iNKT2 和 IL-17^+ iNKT17 細胞亞群的比例。（b）、（d）、（f）、（h）和（j）iNKT1/iNKT2 與 iNKT1/iNKT17 比值。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 EE、ANIT、TCA 或 TCA + CEL 組相比。

雷公藤紅素通過 CTSS-自噬-iNKT1 極化軸減輕 CCl4 誘導的肝纖維化和肝損傷

為評估雷公藤紅素治療其他肝病過程中 CTSS-自噬-iNKT1 極化軸的變化，我們采用了 CCl4 誘導的肝纖維化和急性肝損傷模型（圖 7a 和 o）。雷公藤紅素顯著減輕急性和慢性肝損傷，表現為肝臟病理改善（圖 7b 和 p），小鼠血清 AST 和 ALT 水平降低（圖 7c 和 q），以及細胞上清液中 AST、ALT 和 LDH 水平降低（圖 7r）。

在肝纖維化模型中，雷公藤紅素減少了膠原沉積，表現為 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色減弱（圖 7d），以及血清 PC-III 和 HA 水平降低（圖 7e）。雷公藤紅素還下調了小鼠肝臟中纖維化相關基因（Acta2、Tgfb1、Col1a1 和 Col1a2）和纖維化相關蛋白（α-SMA、COL1A1）的表達（圖 7f 和 g），并在 TGF-β 刺激的 LX-2 細胞中發揮相似作用（圖 7h–j）。

雷公藤紅素抑制了小鼠肝臟中的 CTSS 表達，并促進自噬（圖 7k、l、s 和 u），也在共培養系統的 iNKT 細胞中發揮這一作用（圖 7m、t 和 u）。來自肝硬化患者的臨床單細胞 RNA 測序數據（GSE136103）也顯示，NKT 細胞發生顯著改變，并富集于 Th17 細胞分化、抗原加工與呈遞以及 Th1 和 Th2 細胞分化通路（圖 7n 上）。另一單細胞 RNA 測序數據集（GSE134037）證實，CCl4 處理小鼠 NKT 細胞中 CTSS 表達升高，同時 NKT 細胞發生改變，并富集于溶酶體生物發生、氧化磷酸化和自噬通路（圖 7n 下）。因此，雷公藤紅素通過抑制 CTSS 并恢復 iNKT 細胞中的自噬，減輕 CCl4 誘導的肝纖維化和急性肝損傷。

圖 7｜雷公藤紅素通過 CTSS-自噬-iNKT1 極化軸減輕 CCl4 誘導的肝纖維化和肝損傷。
（a）、（o）實驗示意圖。（b）、（p）肝臟切片 H&E 染色。（c）、（q）血清 AST 和 ALT 水平。（d）肝臟切片 Masson 三色染色和 Sirius Red 染色。（e）血清 PCIII 和 HA 水平。（f）肝臟 Acta2、Tgfb1、Col1a1 和 Col1a2 的 mRNA 表達。（g）、（j）α-SMA 和 COL1A1 的蛋白水平。（h）雷公藤紅素在 LX-2 細胞中的細胞毒性。（i）ACTA2 和 COL1A1 的 mRNA 表達，以及（k）、（s）和（t）Ctss 的 mRNA 表達。（l）免疫組織化學檢測，以及（m）Western blot 檢測 CTSS、p62、Parkin 和 PINK1 蛋白。（n）對肝硬化患者和健康對照（CON，GSE136103）或 CCl4 與對照小鼠肝臟非實質細胞（GSE134037）進行 UMAP 分析；NKT 細胞 KEGG 富集通路分析，以及 NKT 細胞中 CTSS 表達（GSE134037）。（r）細胞上清液中的 AST、ALT 和 LDH 水平。（u）肝組織和 iNKT 細胞中 CTSS 和自噬標志物的蛋白水平。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 CCl4 或 TGF-β 組相比。

雷公藤紅素在 CCl4 誘導的肝纖維化和肝損傷中促進 iNKT1 亞型偏向

炎癥在推動膽汁淤積性肝損傷向肝纖維化進展中發揮重要作用。已有報道表明，iNKT 細胞在 CCl4 誘導的肝纖維化和急性肝損傷中具有保護作用，但肝纖維化發生過程中 iNKT1、iNKT2 和 iNKT17 亞群的具體變化仍不明確。

在肝纖維化和急性肝損傷的體內與體外模型中，雷公藤紅素同樣誘導了 iNKT1 亞型偏向（圖 8a–d）。因此，雷公藤紅素也在其他肝病模型中促進保護性 iNKT1 亞型偏向。iNKT1 細胞分泌的 IFN-γ 可抑制 HSC 活化和增殖。本研究結果為雷公藤紅素抗纖維化作用提供了新的理論依據。

圖 8｜雷公藤紅素在 CCl4 誘導的肝纖維化和肝損傷模型中促進 iNKT1 亞型偏向。
（a）纖維化模型中活化（CD69^+）iNKT 細胞、iNKT1、iNKT2、iNKT17 細胞亞群的比例，以及 iNKT1/iNKT2、iNKT1/iNKT17 比值；（b）共培養系統中 iNKT 細胞的相應結果。（c）急性肝損傷模型中的相應 iNKT 細胞譜系變化；（d）共培養系統中 iNKT 細胞的相應變化。（e）圖形摘要。數據以均值 ± SEM 表示，n = 5；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與對照組相比； < 0.05，# < 0.01，## < 0.001，與 CCl4 或 TGF-β 組相比。

【Citation】:Wang H, Yang M, Zhang S, Mai M, Mei Y, Zhang Y, Zhang L, Liu J, Xing M, Wang X. 2026. Celastrol ameliorates cholestatic liver injury by promoting a protective iNKT1 polarization via CTSS inhibition and autophagy restoration.Targetome2(2): e016.

【貢獻】★★★★★

綜上，雷公藤紅素靶向并抑制 CTSS，增強自噬/線粒體自噬，促進保護性 iNKT1 細胞偏向，從而減輕膽汁淤積性肝損傷和纖維化。CTSS 的遺傳性消除或藥理性抑制，以及使用氯喹藥理性阻斷自噬流，均消除了雷公藤紅素誘導的 iNKT1 極化和肝保護作用，證實 CTSS 依賴的自噬/線粒體自噬增強是雷公藤紅素發揮免疫調節作用的關鍵機制。

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