Mol Cell | 王棟/章佩君團(tuán)隊(duì)解析RNA聚合酶II中的水分子網(wǎng)絡(luò)及其催化功能

水是生命之源，在細(xì)胞層面，水分含量占細(xì)胞總重量的70-80%，是細(xì)胞內(nèi)含量最多的成分。在分子層面，水分子在基因轉(zhuǎn)錄中起到什么樣的作用一直是個(gè)謎團(tuán)。盡管過去 二 十 五 年 來 ，RNA polymerase II（Pol II）的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)取得了 突飛猛進(jìn)的 進(jìn)展 ， 但 這 個(gè)關(guān)鍵問題始終懸而未解 。 由于分辨率限制， 我們對(duì)轉(zhuǎn)錄的理解還是以蛋白質(zhì)為中心。 絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)無法 “看到“ 水分子 ， 使得這一類“看不見”的 重要 成分長(zhǎng)期被忽視 ，我們無法了解 水分子在轉(zhuǎn)錄過程中的結(jié)構(gòu)與功能。

近日，來自 美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校王棟教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合英國(guó)牛津大學(xué)章佩君教授團(tuán)隊(duì) 以及 威斯康星大學(xué)麥迪遜分校黃旭輝教授團(tuán)隊(duì) ，在 Molecular Cell 發(fā)表 題為 Sub-2 ? Cryo-EM Structures of Transcribing RNA Polymerase II Reveal Critical Roles of Water Molecules in Catalysis 的 研究論文（第一作者： 李青嶸博士 、 易剛順博士 ）。該研究解析了亞2 ? 分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，首次 揭示 了轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)下Pol II中的水分子網(wǎng)絡(luò)，并揭示了水分子 ， 這一 轉(zhuǎn)錄體系中的“暗物質(zhì)” ， 在底物識(shí)別 ， 催化反應(yīng) 和蛋白質(zhì)相互作用 中的關(guān)鍵作用機(jī)制 （圖1， 視頻1） 。

圖1. 亞2 ?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)揭示RNA聚合酶II中水分子介導(dǎo)的催化與分子相互作用

視頻 1. 冷凍電鏡密度展示與水分子介導(dǎo)的RNA polymerase II催化及相互作用機(jī)制

背景與挑戰(zhàn)

RNA·聚合酶 II （RNA Pol II ） 是基因表達(dá)過程中最核心的酶之一，負(fù)責(zé)以DNA為模板合成 信使 R NA，是轉(zhuǎn)錄過程的起點(diǎn)。 雖 然 20年前 通過解析 X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu) ， 首次揭示了在 RNA聚合酶 II處于活性狀態(tài)時(shí) （前催化構(gòu)象） ， trigger loop從開放構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)殚]合構(gòu)象在底物識(shí)別和催化過程中的重要作用【1】。 20年來， 已 報(bào)道的 數(shù)以百計(jì)的 RNA聚合酶 II 結(jié)構(gòu)中， 處于 反應(yīng) 活性狀態(tài)：底物結(jié)合且 t rigger loop 處于閉合構(gòu)象 的 RNA聚合酶 II 結(jié)構(gòu)中 不超過4個(gè) 且 均 劣 于3 ?分辨率 。而且由于分辨率的限制， RNA聚合酶 II 的 關(guān)鍵 催化機(jī)制，尤其是質(zhì)子轉(zhuǎn)移 步驟 ， 仍 是領(lǐng)域中 一直懸而未決 的問題 。 我們對(duì) RNA聚合酶 II 的理解 讓只 局限于蛋白質(zhì) ，我們對(duì) 水 分子 在 轉(zhuǎn)錄機(jī)制 的作用 也 并不了解。

核心創(chuàng)新

盡管冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展迅速，但受限于分辨率和取向偏好，既往 的 Pol II 結(jié)構(gòu) 也 難以解析關(guān)鍵水分子及其精細(xì)相互作用。牛津大學(xué)章佩君團(tuán)隊(duì)于2024年開發(fā)了單分散鏈霉親和素親和載網(wǎng)【2】， 用于優(yōu)化顆粒取向并富集樣品。在此基礎(chǔ)上，通過生物素化核酸骨架并結(jié)合鏈霉親和素親和載網(wǎng)，顯著改善了RNA Pol II的取向分布并降低氣-液界面影響，從而解析了1.96 ?分辨率的 反應(yīng) 前催化構(gòu)象 結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化制樣流程，發(fā)展了“底物梯度親和載網(wǎng)”方法，在冷凍前引入底物并延緩反應(yīng)激活，成功捕捉到催化中間態(tài)，并解析了磷酸二酯鍵形成 的中間催化狀態(tài) 。這些技術(shù)進(jìn)展使關(guān)鍵水分子網(wǎng)絡(luò)得以清晰呈現(xiàn)，為深入理解轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。（圖2）

圖2. 基于 單分散鏈霉親和素親和載網(wǎng) 的冷凍電鏡樣品制備流程圖

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)

本研究第一次將RNA聚合酶 II 復(fù)合物在反應(yīng)活性狀態(tài)反應(yīng)前催化構(gòu)象的 結(jié)構(gòu) 的分辨率 大幅 提高 到1 .96 ?分辨率 ， 活性中心的分辨率達(dá)1 .9 2 ? 。 本結(jié)構(gòu)中不但清晰解析了RNA聚合酶II各個(gè)氨基酸 在催化反應(yīng)發(fā)生瞬間 的側(cè)鏈構(gòu)象，更是揭示 高 達(dá)1300多的水分子。這些水分子與RNA聚合酶II形成 此前未被識(shí)別的相互作用網(wǎng)絡(luò)， 比溶液 中 游動(dòng)的水分子穩(wěn)定幾十到上千倍。 這些水分子在轉(zhuǎn)錄中起到重要作用。

1. 水分子 在 參與 底物識(shí)別和 催化反應(yīng) 中發(fā)揮重要作用

首先 在底物結(jié)合區(qū)域，研究觀察到大量水分子的存在，這些水分子構(gòu)建了一個(gè)此前未被識(shí) 別的相互作用網(wǎng)絡(luò)，顯著拓展了我們對(duì) RNA聚合酶對(duì) 底物識(shí)別機(jī)制的理解（圖3）。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，底物識(shí)別主要依賴蛋白質(zhì)殘基與底物之間的直接相互作用，而本研究表明， 除了已知的直接相互作用， 更多的底物識(shí)別作用網(wǎng)是通過水介導(dǎo)的 。 水 分子作為關(guān)鍵“橋梁”，將 底物 與多個(gè) RNA 聚合酶的 結(jié)構(gòu)元件連接起來，使更多氨基酸殘基通過水介導(dǎo)方式參與到底物識(shí)別過程中，從而形成一個(gè)更為復(fù)雜且精細(xì)的識(shí)別網(wǎng)絡(luò)。

圖3. RNA聚合酶II活性中心的電子密度圖

與此同時(shí)，這些 水分子還直接參與了催化反應(yīng)本身 （圖 4 ） 。在活性中心中，與金屬離子Mg2 ? A配位的水分子可作為質(zhì)子受體，促進(jìn)RNA引物3′-OH的去質(zhì)子化，并通過連續(xù)的水分子鏈將質(zhì)子傳遞至溶液環(huán)境；而位于β-磷酸附近的水分子（如W3或W4）則作為質(zhì)子供體參與焦磷酸（ PPi ）的質(zhì)子化過程。 這一系列水分子介導(dǎo)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移事件，從結(jié)構(gòu)層面揭示并完善了RNA 聚合酶 II中SN2催化反應(yīng)的分子機(jī)制。 更為重要的是這些水在大腸桿菌RNA聚合酶的 活性中心 也是 相當(dāng) 保守的 【3】 。 這些發(fā)現(xiàn) 揭示了水分子在轉(zhuǎn)錄過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵且具有進(jìn)化保守性的作用。 包括水 和鎂離子 在內(nèi)的反應(yīng)中心可能在RNA聚合酶的進(jìn)化早期就已經(jīng)出現(xiàn)， 而蛋白質(zhì)的殘基在進(jìn)化中優(yōu)化和穩(wěn)定這個(gè)反應(yīng)中心。

圖 4 水分子參與的RNA polymerase II催化SN2反應(yīng) 機(jī)制

2. 水分子參與trigger loop的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化

除了在催化和底物識(shí)別中的作用外，水分子還在穩(wěn)定關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件 構(gòu)象 方面發(fā)揮重要作用。其中，trigger loop （ TL ） 是位于Rpb1亞基中的一個(gè)核心結(jié)構(gòu)元件， 其構(gòu)象變化 在轉(zhuǎn)錄催化過程中起著至關(guān)重要的功能。 之前的結(jié)構(gòu) 研究表明，當(dāng)?shù)孜镞M(jìn)入活性中心后，TL會(huì)從相對(duì)松散的 開放構(gòu)象 狀態(tài)折疊 為 含 alpha-螺旋 的閉合 構(gòu) 象，從而將底物穩(wěn)定在反應(yīng)位點(diǎn)附近，為催化反應(yīng)提供精確的空間構(gòu)型【1】。本研究的高分辨率結(jié)構(gòu) 發(fā)現(xiàn) ，在TL與周圍結(jié)構(gòu)元件形成的界面區(qū)域中，存在大量水分子。這些水分子并非被動(dòng)存在，而是與TL的構(gòu)象變化過程高度耦聯(lián)：在TL折疊過程中，水分子參與形成橋接氫鍵網(wǎng)絡(luò)，連接TL與多個(gè)功能區(qū)域；而在TL解折疊時(shí)，這些水分子的分布也隨之發(fā)生重排或解離。這表明，水分子作為動(dòng)態(tài)“橋梁”為TL的構(gòu)象轉(zhuǎn)換提供了額外的結(jié)構(gòu)調(diào)控層次。

3. 水分子調(diào)控 蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用

在整個(gè)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中，研究發(fā)現(xiàn)大量水分子分布于蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用界面上，其中蛋白–核酸界面的作用尤為引人關(guān)注。傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)研究普遍認(rèn)為，核酸與蛋白的相互作用主要依賴帶正電的氨基酸殘基（如Arg和Lys）與核酸骨架上的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)之間的 直接靜電作用。然而， 這一認(rèn)識(shí)在很大程度上忽視了水分子的貢獻(xiàn) 。本研究揭示，在RNA–DNA hybrid 區(qū)域，核酸表面被一層穩(wěn)定的水化層（hydration shell）所覆蓋。這一水化層顯著拓展了蛋白–核酸相互作用的方式：水分子作為“橋梁”，通過形成水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使更多類型的氨基酸殘基參與到與核酸的相互作用中，不再局限于傳統(tǒng)的帶正電殘基。值得注意的是，這種水介導(dǎo)的相互作用不僅允許負(fù)電或中性殘基參與其中，還在一定程度上緩沖和重分布了界面電荷，從而構(gòu)建出更加多樣化和靈活的相互作用網(wǎng)絡(luò)。 基 于這一結(jié)構(gòu)觀察，進(jìn)一步提出， 核酸表面的水化層可能在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮“分子潤(rùn)滑劑”的作用。相比于直接的蛋白–核酸接觸，通過水分子介導(dǎo)的相互作用在能量上更易于調(diào)節(jié)和重排，從而有助于RNA 聚合酶 II 在沿著 核酸 模版 骨架 中平滑 移動(dòng) 。 這一機(jī)制為理解轉(zhuǎn)錄延伸過程中 RNA 聚合酶 II 沿著 核酸 模版鏈 快速 運(yùn)動(dòng)提供了新的物理基礎(chǔ)。

總結(jié)

本研究通過亞2 ?分辨率結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)性揭示了水分子在Pol II轉(zhuǎn)錄中的多重功能，不僅 闡述了 完 整的 轉(zhuǎn)錄催化機(jī)制，也打破了傳統(tǒng)“以蛋白為中心”的認(rèn)知框架。這些發(fā)現(xiàn)表明，水分子是轉(zhuǎn)錄機(jī)器中不可或缺的結(jié)構(gòu)與功能組成部分 。 這些發(fā)現(xiàn)為 RNA聚合酶催化機(jī)制提供了前所未有的機(jī)制性見解，并揭示了水分子在轉(zhuǎn)錄過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵且具有進(jìn)化保守性的作用。 此研究代 表了轉(zhuǎn)錄領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，并顯著推進(jìn)了對(duì)核酸酶作用機(jī)制的基礎(chǔ)性理解 ， 為理解核酸酶體系的普適機(jī)制提供了新的視角。 這項(xiàng)研究也 為 未來開展分子動(dòng)力學(xué)研究和時(shí)間分辨結(jié)構(gòu)分析提供了一個(gè)基礎(chǔ)性框架，旨在探究在轉(zhuǎn)錄過程中有序與無序水分子及離子的動(dòng)態(tài)作用。

本文其他 共同 作者還 包括 吳越 （ 威斯康星大學(xué)麥迪遜分校 ） , Jenny Chong （ 加州大學(xué)圣地亞哥分校 ） Sophy Xu （ 加州大學(xué)圣地亞哥分校 ）。

原文鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(26)00241-8

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Wang, D., Bushnell, D.A., Westover, K.D., Kaplan, C.D., and Kornberg, R.D. (2006). Structural Basis of Transcription: Role of the Trigger Loop in Substrate Specificity and Catalysis.Cell127 , 941–954. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.11.023.

2. Ma, J., Yi, G., Ye, M., MacGregor-Chatwin, C., Sheng, Y., Lu, Y., Li, M., Li, Q., Wang, D., Gilbert, R.J.C., et al. (2024). Open architecture of archaea MCM and dsDNA complexes resolved using monodispersed streptavidin affinity CryoEM.Nat Commun15 , 10304. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53745-w.

3. Mueller, A.U., and Darst, S.E. (2026). Structural basis for multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase catalytic activity.Mol. Cell6 , ??? – ??? . https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.03.033 .

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