Chem | 許紅濤/馬培翔/侯衛團隊利用短夾板 RNA 介導的單鏈DNA編碼實現無標記活細胞DEL庫篩選

DNA 編碼化合物庫（DEL）已成為現代小分子藥物苗頭化合物發現的重要技術平臺。類比生物學中心法則，DEL通過“化學中心法則（Chemical Central Dogma，Acta Pharm. Sin. B 2024, 14, 492）”，將基因型（DNA編碼序列）與表型（與DNA共價偶聯的小分子）共價偶聯，實現“小分子— DNA編碼—篩選—解碼”的閉環信息傳遞。其中單鏈 DNA 編碼庫（ssDEL）在復雜靶點適配與活細胞篩選中具備獨特優勢，但傳統 ssDEL的構建方法存在序列冗余、純化繁瑣、連接特異性不足等瓶頸，難以滿足高效建庫與精準篩選的需求。

近日，上?？萍即?strong>許紅濤/上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院馬培翔/浙江工業大學侯衛團隊針對這一挑戰，基于SplintR 連接酶開發了短夾板 RNA 介導的ssDNA 連接體系，建立了高效、特異性的ssDEL構建平臺，實現無標記活細胞水平的超高通量ssDEL篩選，為膜蛋白等難靶藥物發現提供底層技術支撐。該研究成果以Splint RNA-mediated single-stranded DNA-encoded library construction and label-free live-cell selection為題發表在Chem期刊上。

本研究首先系統優化SplintR介導的ssDNA連接條件，闡明連接效率與序列組成的規律。研究證實，SplintR 連接酶可在12–14 nt的短夾板 RNA 驅動下實現高效 ssDNA 連接；該體系對連接位點的單堿基錯配具有嚴格識別能力，從源頭降低編碼錯誤。由此團隊繪制編碼效率圖譜（CEM），明確受體序列與供體序列的優勢堿基組合，實現夾板 RNA 的精準設計與高效連接。連接后夾板 RNA 可經 RNase H 快速去除，無需復雜純化，顯著提升 ssDEL 純度與合成便捷性。

基于優化的連接體系，團隊成功構建 ssDEL 合成與篩選技術體系。采用 “split-and-pool” 策略，完成10?量級的驗證庫與2.95×10?量級的多樣性庫的高效合成，PAGE 與 NGS 驗證文庫均一性與完整性。對比篩選顯示，ssDEL 較傳統雙鏈 DEL（dsDEL）空間位阻更小，靶點富集效率提升約 2.7 倍；短序列 ssDNA（60 nt）較長序列 ssDNA（110 nt）富集效率提升約 8 倍。該體系兼容 DNA 兼容化學反應，可實現多模塊砌塊拼接，為大規模 ssDEL 標準化制備提供可行方案。

團隊進一步開發SplintR 介導鄰近連接 PCR 方法（SIMPL），實現無標記活細胞水平的精準篩選。該方法無需蛋白固定、熒光標記或細胞改造，依靠配體與識別探針結合帶來的核酸鄰近效應觸發連接，實現高靈敏度檢測。針對活細胞表面腫瘤相關靶點 CAXII，從 295 萬庫容的 ssDEL 中直接篩選獲得 4個高親和力配體，其中最優化合物的解離常數達到亞納摩級別。該技術突破活細胞篩選瓶頸，適用于可溶性蛋白與膜蛋白靶點，為新藥發現提供更接近生理環境的篩選范式。

項目團隊長期聚焦于DEL技術的基礎與應用研究，發展了一系列DNA兼容的化學反應，包括Se-N交換點擊化學（SeNEx，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202318534）等；并率先在國際上系統開展DNA編碼天然產物庫（nDEL, Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 9254）及含硒DNA編碼化合物庫（SeDEL，Angew. Chem. Int. ed. 2020, 59, 13273; 2022, 61, e202206516; 2025, 64, e202500942; Chem, 2023, 9, 3335）的構建與篩選研究，顯著拓展了DEL庫的化學空間。未來，隨著體系進一步優化，該平臺有望拓展至更多疾病相關膜蛋白、GPCR、離子通道等難靶靶點的配體發現，并可與共價篩選、構象選擇性篩選、體內原位篩選等方向結合，推動新藥發現從體外蛋白水平走向細胞與活體水平，加速先導化合物發現與臨床轉化進程。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451929426000112

制版人： 十一

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