Science丨揭示L1逆轉(zhuǎn)座如何在腫瘤早期制造染色體互易易位

撰文｜雪月

L1逆轉(zhuǎn)座（ LINE-1 L1 retrotransposition ） 在腫瘤基因組中普遍存在，并可通過 “ 復(fù)制 - 粘貼 ” 式插入引發(fā)插入突變及大片段缺失等結(jié)構(gòu)變異。然而，由于短讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)χ貜?fù)序列與復(fù)雜斷點(diǎn)的解析能力有限， L1 是否以及如何促進(jìn)平衡型結(jié)構(gòu)變異（如互易易位）仍缺乏系統(tǒng)性證據(jù)。

來自西班牙圣地亞哥－德孔波斯特拉大學(xué)Jose M. C.Tubio團(tuán)隊(duì)在 Science 上發(fā)表題為 Concurrent L1 retrotransposition events promote reciprocal translocations in human tumorigenesis 的文章。 本研究以“逆轉(zhuǎn)座高活性腫瘤”作為富集模型，結(jié)合長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序與專門算法，旨在在序列層面直接重建L1相關(guān)斷點(diǎn)結(jié)構(gòu)，并據(jù)此推斷其導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)重排類型、頻率與發(fā)生時(shí)間。

作者對(duì) 137 例腫瘤進(jìn)行淺層 Illumina WGS 初篩以評(píng)估體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)座負(fù)荷，并選取其中 10 例逆轉(zhuǎn)座事件數(shù) >100 的腫瘤作為 “golden set” 。隨后對(duì)這 10 例腫瘤及配對(duì)鄰近正常組織進(jìn)行 ONT 長(zhǎng)讀長(zhǎng)全基因組測(cè)序 。 為解析長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)中的逆轉(zhuǎn)座插入與結(jié)構(gòu)后果，作者開發(fā) MEIGA ，可識(shí)別并重建 7 類逆轉(zhuǎn)座插入，并檢測(cè) “ 由新獲得逆轉(zhuǎn)座插入橋接兩個(gè)遠(yuǎn)端斷點(diǎn) ” 的逆轉(zhuǎn)座介導(dǎo)基因組重排 。

方法學(xué)可靠性通過模擬數(shù)據(jù)基準(zhǔn)測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)在插入負(fù)荷最高的樣本中引入 PacBio HiFi 與 Illumina 數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，并對(duì)部分 “MEIGA 獨(dú)有 ” 事件做 IGV 目檢確認(rèn)。對(duì)關(guān)鍵互易易位，作者進(jìn)一步采用 long-range PCR 排查斷點(diǎn)處是否存在 “ 預(yù)先存在的 L1 中間體 ” ，并在細(xì)胞系 NCI-H2009 中結(jié)合 FISH 與 Micro-C 等正交手段驗(yàn)證跨染色體結(jié)構(gòu)。分子計(jì)時(shí)方面，作者結(jié)合 VAF 、局部拷貝數(shù)與 WGD 定時(shí)框架，將插入 /RT-RG 劃分為克隆早期與晚期等類別，并以 “ 時(shí)鐘樣 ” 突變推斷 WGD 與診斷時(shí)間的相對(duì)關(guān)系。

在 10 例高活性腫瘤中， MEIGA 共鑒定 6,418 個(gè)體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)座事件（中位數(shù) 622.5/ 例；范圍 296–1,311 ）。值得注意的是，與長(zhǎng)讀長(zhǎng)結(jié)果相比，短讀長(zhǎng)流程漏檢了 43% 的經(jīng)典插入事件（ 2,697/6,266 ），提示在高重復(fù)序列背景下，短讀長(zhǎng)對(duì)插入負(fù)荷的估計(jì)可能存在系統(tǒng)性低估。在多平臺(tái)驗(yàn)證中，插入最多的樣本中 92.5% 的典型插入可被至少一種獨(dú)立平臺(tái) / 流程支持，同時(shí)對(duì) “MEIGA 獨(dú)有 ” 事件的目檢也支持其為真實(shí)體細(xì)胞插入，增強(qiáng)了后續(xù)結(jié)構(gòu)推斷的可信度。

在 golden set 中，作者識(shí)別出 152 個(gè) RT-RG （約占全部體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)座事件的 ~2% ）。 RT-RG 的類型譜顯示，缺失仍為最常見類型（ 43% ），但跨染色體重排占 30% ，倒位與重復(fù)分別占 18% 與 9% ，提示 L1 活動(dòng)不僅造成局部插入或缺失，也可參與更大尺度的基因組結(jié)構(gòu)重塑。在跨染色體事件中，約 44% （ 20/45 ）參與形成 13 個(gè)互易易位，這一 “ 平衡型交換 ” 在以往短讀長(zhǎng)研究中不易捕捉，因而可能長(zhǎng)期被低估。

作者對(duì)互易易位斷點(diǎn)進(jìn)行序列層面精細(xì)解析，發(fā)現(xiàn)多例易位的兩條衍生染色體連接處分別包含不同的 L1 插入片段，并呈現(xiàn) poly(A) 尾、 L1 內(nèi)切酶切割基序及短微同源等特征；此外，斷點(diǎn)附近靶位點(diǎn)特征在兩條非同源染色體間呈 “ 互換 ” 樣式，符合 “ 兩次獨(dú)立插入在時(shí)間上并發(fā) / 緊鄰發(fā)生后被共同解析 ” 的模型。

為檢驗(yàn)替代解釋（例如斷點(diǎn)處存在預(yù)先形成的 L1 中間體并隨后發(fā)生重組），作者采用 long-range PCR 檢測(cè)斷點(diǎn)區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)支持 “ 預(yù)先存在中間體 ” 的證據(jù)，從而進(jìn)一步反對(duì) “ 先插入后同源重組 ” 的路徑。

統(tǒng)計(jì)上， 13 個(gè)互易易位中有 10 個(gè)更符合 “ 兩次插入共同參與 ” 的結(jié)構(gòu)模式，并且 long-range PCR 未檢測(cè)到 pre-existing 元件，整體支持 “ 并發(fā)或緊密連續(xù)發(fā)生 ” 的機(jī)制解釋。

為提供獨(dú)立體系的直接證據(jù)，作者進(jìn)一步在肺腺癌細(xì)胞系 NCI-H2009 中進(jìn)行 ONT+MEIGA 分析并發(fā)現(xiàn) chr3q–chr6q 的互易易位由兩個(gè)獨(dú)立 L1 插入橋接；隨后 FISH 觀察到符合預(yù)期的易位構(gòu)型， Micro-C 也在預(yù)測(cè)斷點(diǎn)處顯示跨染色體互作信號(hào)，從細(xì)胞遺傳學(xué)與三維基因組層面共同驗(yàn)證了該互易易位的真實(shí)存在及其斷點(diǎn)結(jié)構(gòu)。

基于納米孔數(shù)據(jù)的甲基化分析顯示，體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)座事件數(shù)與 L1 啟動(dòng)子甲基化水平呈顯著負(fù)相關(guān)（ r = ?0.537 ， P = 0.015 ），并且新獲得插入的 L1 往往也呈低甲基化，提示 L1 去甲基化 / 解抑制可能與逆轉(zhuǎn)座爆發(fā)相關(guān)。在 20 個(gè)腫瘤樣本的分析中， RT-RG 數(shù)與插入數(shù)呈正相關(guān)（ r = 0.66 ， P = 0.001 ），支持 “ 逆轉(zhuǎn)座活躍度越高，發(fā)生結(jié)構(gòu)重排的機(jī)會(huì)越大 ” 的總體趨勢(shì)。同時(shí)，在 RT-RG 負(fù)擔(dān)最高的樣本中觀察到 Fanconi anemia （ FA ）通路關(guān)鍵基因的雙等位突變，為復(fù)制叉保護(hù) / 修復(fù)通路影響 L1 相關(guān)結(jié)構(gòu)重排風(fēng)險(xiǎn)提供了線索性關(guān)聯(lián)。在可定時(shí)的典型插入中，約 64.1% 被歸類為克隆早期事件，提示逆轉(zhuǎn)座活動(dòng)在腫瘤克隆擴(kuò)張?jiān)缙谝褟V泛發(fā)生。

結(jié)合 “ 時(shí)鐘樣 ” 突變推斷， WGD 的發(fā)生中位時(shí)間約為診斷前 4.77 年，且所有分析腫瘤在 WGD 前均已發(fā)生大量逆轉(zhuǎn)座事件。對(duì) RT-RG 而言，可置信定時(shí)的事件中約 3/4 為早期克 隆事件；尤其是 L1 介導(dǎo)的互易易位中，有 9 個(gè)發(fā)生在 WGD 之前，最早可推斷至診斷前 8.87 年以上，強(qiáng)調(diào) L1 活動(dòng)可能在腫瘤演化早期就參與推動(dòng)染色體結(jié)構(gòu)重排與不穩(wěn)定。

這項(xiàng)工作將L1的角色從“插入突變?cè)?/strong>”拓展為“結(jié)構(gòu)重排生成機(jī)制”，為理解腫瘤染色體不穩(wěn)定的起源與早期演化提供了新的可檢驗(yàn)框架。

原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aee4513

制版人： 十一

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