Nature | 劉彬/薛文/Sontheimer團隊開發?Prime Assembly，實現最大?11 kb?基因組大片...

基因治療的核心目標之一，是將一段功能正常的基因“原裝”替換患者體內的致病序列。然而，這一目標長期面臨關鍵技術瓶頸——如何在不引入雙鏈斷裂（DSB）的前提下，將基因級別大小（>1 kb）的 DNA 片段高效、精準地寫入哺乳動物基因組。

精準大片段基因插入一直是基因編輯領域的“硬骨頭”。基于 DSB 的 NHEJ/HDR 策略存在隨機插入、細胞毒性及體內遞送效率低等問題；以prime editing（PE）為核心的新一代工具（如 PASTE、PASSIGE）雖避免了 DSB，但依賴整合酶或重組酶，仍存在 junction scar、免疫原性及遞送復雜性等挑戰。更關鍵的是，現有 PE 相關技術在 >400 bp 插入時效率顯著下降，距離真正的基因治療應用仍有差距。此外，質粒供體在體內攝取效率低且易激活免疫反應，也限制了其轉化潛力。

近日，The Ohio State University 醫學院劉彬團隊，聯合 UMass Chan Medical School RNA 治療研究所薛文與Erik J. Sontheimer團隊，在Nature雜志發表了題為： 的研究論文，報道了一種全新的大片段基因組插入策略——Prime Assembly（PA）。該方法實現了從0.1 kb到11 kb的精準插入，對0.8 kb供體的插入效率最高可達50%，且無需DSB、重組酶或同源定向修復（HDR）。

PA 的核心思路簡潔而巧妙：twin prime editing（twinPE）可在基因組靶點兩側生成約 35 nt 的單鏈 flap。如果將線性雙鏈 DNA（dsDNA）供體兩端設計為與這些 flap 互補，是否可以利用細胞內源修復機制，實現大片段 DNA 的精準拼接？研究者將 PCR 擴增獲得的線性 dsDNA 供體與 PE6c 及 twin-epegRNA 共轉染至 HEK293T 細胞，成功在 AAVS1 位點實現 0.8 kb、2.2 kb 和 4 kb 片段的高效定向插入，效率顯著優于 evoCAST 和 PAINT 3.0。值得注意的是，PA 不依賴外源 DNA 聚合酶，在 G1 及 G2/M 阻斷條件下依然高效，提示其機制獨立于細胞周期及經典 HDR 通路—這一特性對于原代細胞和體內應用尤為重要。

此外，利用了多項技術創新提升效率與精準性：① DNA-PK 抑制提升效率：NHEJ 抑制劑 AZD-7648 可顯著提升 PA 效率，并將 flap 區域 indel 率由 12–17% 降至 9% 以下；結合 odsDNA 供體時，錯誤率可降至 ~0.6%，接近測序背景水平；② 3′ 懸掛單鏈供體（odsDNA）：通過 λ 外切酶處理 PCR 產物生成 3′ 懸掛結構，提高與 flap 的退火效率，大幅提升精準度；③ 細胞內 Gibson 拼裝（多供體 PA）：受 Gibson Assembly 啟發，研究者將長供體拆分為多個具有約 30 bp 重疊的片段，實現細胞內多片段同步拼裝插入，為突破 AAV 4.7 kb 遞送限制提供了新思路；④ 多樣化供體形式：包括單鏈 DNA（ssDNA）在內的多種供體形式均適用于 PA，進一步增強了供體設計與遞送的靈活性。

作為技術能力的關鍵驗證，研究團隊成功將 11.3 kb 的 DMD（抗肌萎縮蛋白）cDNA 精準插入 AAVS1 位點，并通過 ddPCR、junction PCR 及 Nanopore 長讀長測序多重驗證其準確性。此外，PA 還可將 2.4 kb 的 CD19 CAR-P2A-GFP 精準整合至 TRAC 位點，為 CAR-T 細胞治療提供了有力工具。研究團隊開發了適用于 PA 的脫靶檢測方法 PA-tag（基于 PE-tag/UDiTaS 改良）。全基因組分析顯示，PA 具有高度位點特異性，無論使用 dsDNA、odsDNA 還是 ssDNA 供體，均未檢測到顯著脫靶信號。

Prime Assembly的提出，為基因組大片段精準插入提供了一條兼具高效率、高精準性與高簡便性的新路徑。其“無 DSB、無整合酶、無質粒、供體可由 PCR 直接制備”的特點，為未來非病毒體內遞送奠定了重要基礎。盡管 PA 的分子機制仍有待進一步闡明，其體內應用仍面臨關鍵挑戰，包括 DNA-PK 抑制策略的安全性評估以及高效遞送體系的建立。隨著這些問題的逐步解決，PA 有望在基因治療領域展現出廣闊的應用前景。

劉彬為第一作者及共同通訊作者，薛文與 Sontheimer 為共同通訊作者。目前 Bin Liu 教授課題組正在招聘博士后，歡迎有興趣的研究人員聯系咨詢。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10460-4

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