Acta Pharmacol Sin I 天然植物甾醇發力：β-谷甾醇激活脂滴自噬，精準清除MASH肝臟脂毒性 (孫慧君-大連醫科大學)

2026年1月7日，大連醫科大學藥學院臨床藥理學教研室孫慧君團隊 在Acta Pharmacologica Sinica （中科院2區，IF=8.4）在線發表題為 “β-Sitosterol ameliorates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by targeting the RAC1/mTOR/TFEB axis thus activating lipophagy-lysosomal pathway” 的研究論文。該研究聚焦代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（MASH）這一代謝性肝病關鍵問題，圍繞天然植物甾醇 β-谷甾醇（β-Sitosterol，β-SIT）改善肝臟脂質蓄積、脂滴自噬障礙和溶酶體功能損傷的作用及機制展開系統研究。

研究團隊采用膽堿缺乏、L-氨基酸限定高脂飲食（CDAHFD）和高脂飲食（HFD）分別構建小鼠 MASH 模型，并結合游離脂肪酸誘導的AML-12和HepG2肝細胞脂質過載模型，從體內外多層面驗證 β-SIT 的治療作用。結果顯示，β-SIT 可顯著降低肝組織 TG 水平，改善血脂譜，減輕肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤和肝纖維化，并降低血清 ALT、AST 水平，提示其具有明確的抗 MASH 和肝保護作用。

機制上，該研究發現，β-SIT 并非單純通過抑制脂肪酸合成發揮作用，而是主要通過增強脂肪酸 β 氧化、促進脂滴降解和激活脂滴自噬來恢復肝臟脂質穩態。進一步研究表明，β-SIT 可增強自噬流，促進溶酶體生物發生，并加強溶酶體與脂滴之間的相互作用，從而推動脂滴進入溶酶體降解通路，清除肝細胞內異常堆積的脂滴。

值得關注的是，研究通過生物信息學預測、分子對接、分子動力學模擬和細胞熱轉變實驗確認RAC1 是 β-SIT 的直接作用靶點。β-SIT 通過靶向 RAC1，抑制 mTOR 通路過度激活，并促進 TFEB 核轉位，進而恢復脂滴自噬-溶酶體通路功能。RAC1 過表達可明顯削弱 β-SIT 對脂滴清除、自噬流恢復和 MASH 改善的作用，而 RAC1 敲低則進一步增強 β-SIT 的保護效應，證實 RAC1 是其發揮作用的關鍵節點。

此外，該研究進一步揭示，β-SIT 可破壞溶酶體膜上 RAC1 與 mTOR 的異常相互作用，降低溶酶體局部 p-mTOR 水平，解除 mTOR 對 TFEB 的抑制，使 TFEB 入核并啟動溶酶體生物發生和自噬相關基因表達。由此，β-SIT 可從“靶向 RAC1—抑制 mTOR—激活 TFEB—重啟脂滴自噬”這一連續機制鏈條上修復 MASH 中受損的脂質清除系統。

該研究系統闡明了 β-谷甾醇通過 “RAC1/mTOR/TFEB 軸—脂滴自噬—溶酶體通路” 改善 MASH 的新機制，為天然植物活性成分干預代謝性脂肪性肝炎提供了新的實驗依據，也為靶向脂滴自噬-溶酶體功能障礙治療 MASH 提供了重要思路。

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【摘 要】

代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）是代謝功能障礙相關性脂肪性肝病（MAFLD）的一種炎癥性亞型，可導致肝功能異常，并造成嚴重健康負擔。脂滴自噬功能障礙會破壞脂滴降解并誘導溶酶體損傷，與 MASH 進展密切相關。因此，靶向激活脂滴自噬-溶酶體通路已成為治療 MASH 的一種有前景策略。

β-谷甾醇（β-sitosterol，β-SIT）來源于水蓼（Polygonum hydropiper L.），其結構與膽固醇相似，并具有神經保護、抗糖尿病和抗肥胖等生物活性。本研究探索了 β-SIT 治療 MASH 的潛力。

研究分別采用膽堿缺乏、L-氨基酸限定高脂飲食（CDAHFD）喂養 10 周，或高脂飲食（HFD）喂養 12 周，建立 MASH 小鼠模型。體外實驗中，采用游離脂肪酸混合物處理 AML-12 細胞，以模擬脂質過載狀態。MASH 小鼠每日灌胃給予 β-SIT 10 或 20 mg/kg，持續 10 周。

結果顯示，β-SIT 通過增強體內外脂滴自噬-溶酶體通路，以劑量依賴方式緩解 MASH。在 FFA 刺激的 AML-12 細胞中，β-SIT 20 μM 可激活自噬流、促進溶酶體生物發生，并增強溶酶體與脂滴之間的相互作用。這些結果通過透射電鏡、多結構光照明顯微鏡實時熒光監測以及脂滴自噬相關標志物檢測得到證實。

通過生物信息學、分子動力學模擬、細胞熱轉變實驗（CETSA）和功能實驗等綜合方法，研究發現 β-SIT 可通過直接靶向 Ras 相關 C3 肉毒毒素底物 1（RAC1），抑制 MASH 小鼠中 mTOR 通路激活。進一步通過成像/三維重建、共免疫沉淀、免疫熒光共定位、溶酶體分離和生化分析，研究證實 β-SIT 可調控 FFA 刺激 AML-12 細胞中溶酶體上的 RAC1/mTOR 相互作用，從而恢復脂滴自噬功能。

關鍵的是，β-SIT 通過調控 RAC1-mTOR 軸，促進轉錄因子 EB（TFEB）核轉位，進而修復脂滴自噬-溶酶體缺陷并減輕 MASH 進展。研究結果提示，靶向 RAC1-mTOR-TFEB 軸是 β-SIT 調控脂滴自噬-溶酶體功能的新機制，并支持 β-SIT 作為 MASH 治療候選藥物的潛力。

關鍵詞:代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎；β-谷甾醇；RAC1；mTOR；TFEB；脂滴自噬-溶酶體通路

01

研究背景及科學問題

生活方式改變導致代謝相關脂肪性肝?。∕AFLD）患病率顯著升高，其中多達 30% 的患者會進展為代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎（MASH）。MASH 以肝脂肪變性、炎癥和纖維化為主要特征，最終可能進展為肝硬化和肝細胞癌，因此帶來嚴重公共衛生負擔。

目前，MASH 的治療主要依賴生活方式干預以及間接作用藥物，如降脂藥和保肝藥。然而，患者長期依從性較差，加之現有治療對阻止疾病進展的效果有限，提示亟需開發針對 MASH 發病機制的藥物。

近年來，天然植物活性成分因療效顯著、副作用較低而受到廣泛關注，被認為是 MASH 治療的重要突破口。β-谷甾醇是一種與膽固醇結構相似的植物甾醇，已有研究報道其具有神經保護、抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖和抗炎等作用，這些藥理活性與代謝綜合征相關疾病的治療靶點高度契合。然而，β-SIT 改善 MASH 的機制仍不清楚。因此，本研究探討 β-SIT 減輕肝臟脂質代謝紊亂及脂滴蓄積導致 MASH 的治療潛力。

大脂滴自噬，以下簡稱脂滴自噬，是哺乳動物細胞選擇性自噬脂滴的關鍵保守機制。在該過程中，自噬囊泡首先包裹脂滴，隨后與溶酶體融合，使脂質被酶促降解。慢性高脂飲食或 CDAHFD 誘導的肝細胞脂質過度沉積會破壞自噬體-溶酶體融合，阻斷自噬流并加重溶酶體損傷，從而共同推動 MASH 和代謝綜合征進展。

持續性脂滴聚集不僅啟動 MAFLD/MASH 的發生，還會通過自我強化循環持續加重肝細胞損傷。已有實驗提示，如果不能解決自噬受損導致的脂肪變性和脂滴堆積，MASH 進展很難逆轉。本研究發現 β-SIT 可顯著抑制脂滴沉積并強效誘導脂滴自噬，為理解 β-SIT 改善 MASH 的分子機制提供了關鍵線索。

基于上述發現，研究進一步通過生物信息學數據庫預測發現，RAC1 可能是 β-SIT 改善 MASH 中脂滴自噬失調的關鍵介導分子。RAC1 是調控自噬的重要信號轉導分子，具有雙重作用：一方面可激活 mTOR 信號通路，另一方面可直接抑制自噬體-溶酶體融合，從而抑制自噬流。機制上，RAC1 與 mTORC1 可共同定位于溶酶體膜上，RAC1 可與 mTOR 發生物理結合并調節其活性。

此外，RAC1 過度激活還可通過促進脂質沉積、抑制脂肪酸 β 氧化、誘導肝星狀細胞介導的纖維化等多條途徑加重 MASH 病程。因此，靶向 RAC1 驅動的脂滴自噬失調，可能是阻斷 MASH 進展的重要治療策略。

進一步機制研究顯示，RAC1 激活的 mTOR 信號可抑制 TFEB。TFEB 是溶酶體生物發生和脂質代謝的主調控因子，對脂滴自噬終末步驟至關重要。在營養充足條件下，mTORC1 通過磷酸化將 TFEB 滯留于胞質中，從而抑制其轉錄活性。TFEB 可通過激活溶酶體酶、調節過氧化物酶體通路、增強脂滴自噬介導的脂滴降解等方式協調脂質穩態，而這些過程在 MASH 中均明顯受損。

本研究證明，RAC1 可通過整合 mTOR-TFEB 信號軸調控溶酶體功能，而 β-SIT 能夠特異性靶向 RAC1-mTOR-TFEB 軸，在小鼠和肝細胞中恢復脂滴自噬功能。這些發現不僅提示 β-SIT 具有作為 MASH 治療候選藥物的潛力，也為靶向脂滴自噬-溶酶體通路改善肝臟脂質蓄積提供了機制基礎。

02

重要發現及亮點

1. β-SIT 減輕 FFA 誘導肝細胞脂質蓄積

為考察 β-SIT 在體外對 MASH 的治療作用，研究采用游離脂肪酸混合物處理 AML-12 細胞，以模擬脂質過載狀態。CCK-8 實驗顯示，無論是否存在 FFA，即使 β-SIT 濃度達到 40 μM，也未表現出明顯細胞毒性。

油紅 O 和 BODIPY493/503 染色顯示，FFA 誘導可使 AML-12 細胞脂滴增大并發生脂質蓄積，而不同劑量 β-SIT 或陽性藥物瑞舒伐他汀均可顯著逆轉這些變化。細胞 TG 和 TC 水平檢測顯示，20 μM β-SIT 的降脂效果與瑞舒伐他汀相近。研究在 FFA 處理的 HepG2 細胞中重復關鍵實驗，也得到相似結果：β-SIT 可降低脂滴蓄積、改善脂肪變性，并降低 TC 和 TG 水平，同時不影響細胞活力。以上結果表明，β-SIT 具有顯著降脂作用。

進一步檢測脂質代謝相關蛋白發現，β-SIT 下調脂滴相關蛋白 PLIN2 表達，同時上調脂肪酸氧化關鍵調控蛋白 PPARα 和 CPT1α，其效果與瑞舒伐他汀相當。這提示 β-SIT 可能通過促進脂滴分解和脂肪酸 β 氧化減少肝細胞脂質沉積。

此外，β-SIT 還下調脂肪酸合成相關蛋白 ACC1、SREBP1 和 SCD1，但其對脂肪酸合成的抑制作用略弱于瑞舒伐他汀?？傮w來看，β-SIT 主要通過增強脂肪酸氧化、促進脂解和抑制脂滴蓄積改善脂質代謝。綜合不同濃度效果，20 μM β-SIT 在抑制脂滴沉積、降低 TG/TC 水平和促進脂滴降解方面作用最強，因此后續實驗選用該濃度。

圖1 β-SIT 改善 FFA 誘導的體外脂質沉積。
A：β-SIT 的化學結構；
B、C：β-SIT 在有或無 FFA 條件下對 AML-12 細胞活力的影響；
D：采用油紅 O 和 BODIPY493/503 染色觀察脂滴聚集，比例尺：10 μm；
E：油紅 O 陽性面積定量分析；
F：BODIPY493/503 熒光強度定量，并按細胞面積進行體積歸一化；
G、H：檢測 10、20、40 μM β-SIT 以及 5 μM 陽性藥物瑞舒伐他汀對 TG 和 TC 的影響；
I、J：檢測 CPT1α、PPARα 和 PLIN2 蛋白表達變化；
K、L：檢測 ACC1、SREBP1 和 SCD1 蛋白表達變化。
數據以均數 ± SEM 表示。采用單因素方差分析。**P<0.01，***P<0.001 vs. 對照組；<0.05，#<0.01 vs. FFA 模型組；n.s. 表示無顯著差異。

2. β-SIT 減輕 CDAHFD 和 HFD 誘導的小鼠 MASH

CDAHFD 飲食可在 C57BL/6 小鼠中快速誘導 MASH 病變，并導致明顯體重下降。為評估 β-SIT 療效，研究設置六個實驗組。連續 10 周 β-SIT 干預后，高劑量 β-SIT 可減輕 CDAHFD 誘導的體重下降，降低肝臟/體重比，且不影響食物攝入。

β-SIT 還降低肝臟 TG 水平，并改善 CDAHFD 小鼠血清脂質譜。肝臟大體形態、H&E 染色、油紅 O 染色、Masson 染色和 F4/80 免疫熒光染色共同證實，高劑量 β-SIT 可顯著緩解 CDAHFD 誘導的肝脂肪變性、纖維化和免疫細胞浸潤。NAFLD 活動評分進一步提示，高劑量 β-SIT 的療效與陽性對照瑞舒伐他汀相當。

血清生化檢測顯示，β-SIT 顯著降低 MASH 模型小鼠 AST 和 ALT 水平，提示其可有效減輕肝損傷。值得注意的是，β-SIT 不改變血清肌酐和尿素氮水平，說明其未表現出明顯腎毒性，安全性較好。

在 CDAHFD 小鼠肝組織中，β-SIT 上調 PPARα 和 CPT1α 表達，下調 PLIN2 表達，提示其可改善脂質代謝紊亂并促進脂解。同時，β-SIT 下調 ACC1、SREBP1 和 SCD1 等脂肪酸合成蛋白，但其抑制脂肪酸合成的作用弱于瑞舒伐他汀。整體而言，體內結果與體外結果一致，表明 β-SIT 主要通過促進脂質分解代謝，包括脂肪酸氧化和脂滴降解，而非主要依賴抑制脂肪酸合成來改善 MASH。

為彌補 CDAHFD 模型膽堿缺乏的局限，研究進一步在傳統 HFD 模型中驗證 β-SIT 療效。HFD 喂養小鼠并給予 β-SIT 20 mg/kg 干預 12 周后，β-SIT 仍可顯著降低體重、肝臟/體重比和附睪白色脂肪組織重量，同時改善肝臟 TG 含量、血清 AST/ALT 和血脂譜。組織學分析顯示，β-SIT 可緩解 HFD 小鼠肝細胞氣球樣變、細胞腫脹和壞死，同時減輕肝纖維化、免疫細胞浸潤和脂滴蓄積。此外，β-SIT 還可減小脂肪細胞面積，改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性，并恢復脂肪酸氧化和脂滴相關蛋白表達。以上結果說明，β-SIT 在 CDAHFD 和 HFD 兩種 MASH 小鼠模型中均可減輕肝脂肪變性并恢復脂質代謝穩態。

圖2 β-SIT 改善 CDAHFD 和 HFD 飲食誘導的小鼠 MASH。
A：研究設計。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型，并給予低劑量 β-SIT（10 mg/kg）、高劑量 β-SIT（20 mg/kg）和陽性對照瑞舒伐他?。?0 mg/kg）干預 10 周后分析，n=8；
B：肝臟重量/體重比；
C：小鼠肝臟 TG 含量；
D：小鼠血清 TG、TC、LDL、HDL 水平；
E–I：肝臟大體形態、H&E 染色、油紅 O 染色、Masson 染色和 F4/80 陽性免疫熒光，以及 NAS 評分和組織學評價；
J、K：小鼠血清 ALT 和 AST 水平；
L、M：不同組小鼠肝組織中 CPT1α、PPARα 和 PLIN2 蛋白表達變化。
原始放大倍數 ×40，比例尺：50 μm，局部放大圖 20 μm；肝臟比例尺：1 cm。數據以均數 ± SEM 表示。**P<0.01，***P<0.001 vs. 對照組；<0.05，#<0.01 vs. CDAHFD 模型組；n.s. 表示無顯著差異。

3. β-SIT 通過增強自噬流和恢復脂滴自噬，改善 FFA 誘導的肝細胞脂質蓄積

過量 FFA 會導致肝細胞脂滴堆積。脂滴自噬可通過調節脂肪酸氧化和分解代謝促進脂滴降解，從而維持脂質穩態。前述結果顯示，β-SIT 可抑制脂滴沉積并促進脂解，因此研究進一步探討 β-SIT 是否通過激活脂滴自噬和增強自噬流減少脂質蓄積。

在 FFA 刺激的肝細胞中，與 BSA 組相比，自噬標志物 LC3B-II 蛋白表達顯著下降，自噬底物 p62 表達升高。同時，ATG5、ATG7 和 Beclin-1 等自噬相關蛋白表達下調。而 β-SIT 干預可逆轉上述變化，提示 β-SIT 可對抗 FFA 誘導的自噬溶酶體降解障礙或自噬流受損，從而改善脂質蓄積。

為探討 β-SIT 增強自噬流的機制，研究將mCherry-eGFP-LC3B質粒轉染入細胞。超分辨率顯微鏡觀察顯示，FFA 誘導的肝細胞中脂滴明顯堆積，同時溶酶體數量減少、亞細胞超微結構受損。β-SIT 處理后，溶酶體數量明顯增加，脂滴沉積減輕。熒光成像分析顯示，FFA 處理細胞中黃色熒光點增加、單紅色熒光信號減少，提示自噬流受損；β-SIT 處理后紅色熒光點明顯增加，說明受阻的自噬流得到恢復。

為進一步驗證該作用，研究使用氯喹阻斷自噬體與溶酶體融合，并通過計算凈 LC3B-II 流評估自噬流。Western blot 結果顯示，FFA 處理后凈 LC3B-II 流顯著下降，而 β-SIT 可明顯逆轉該變化；但氯喹可拮抗 β-SIT 的有益作用。BODIPY493/503 染色也證實，β-SIT 可改善 FFA 誘導的脂質蓄積，而氯喹可抵消這一作用。這些結果說明，β-SIT 通過恢復自噬流和促進脂滴自噬減輕肝脂肪變性。

進一步檢測 LAMP1 免疫熒光發現，FFA 暴露顯著減少溶酶體數量并損害溶酶體功能，而 β-SIT 不僅逆轉這些變化，還恢復溶酶體完整性。為觀察溶酶體與脂滴的相互作用，研究采用超分辨率顯微鏡追蹤活細胞中溶酶體和脂滴的空間關系。結果顯示，β-SIT 顯著增強溶酶體與脂滴的共定位，并可見溶酶體膜包裹脂滴。

時間延遲成像進一步顯示，β-SIT 處理 0 h 時，脂滴與溶酶體之間幾乎無明顯共定位或相互作用；處理 12 h 后，出現明顯溶酶體募集和兩種細胞器之間的瞬時接觸；處理 24 h 后，溶酶體與脂滴的相互作用明顯增強，共定位更加突出。總體表明，β-SIT 可通過增強自噬流、激活脂滴自噬以及加強脂滴-溶酶體相互作用改善脂質沉積。

圖3 β-SIT 激活 FFA 處理肝細胞中的自噬流和脂滴自噬。
A–D：Western blot 檢測 FFA 誘導肝細胞經 β-SIT 處理后 LC3B-II、p62、PLIN2、ATG5、ATG7 和 Beclin-1 蛋白水平；
E、F：轉染 mCherry-GFP-LC3B 質粒的 AML-12 細胞用于評估自噬流，并展示代表性圖像。黃色點代表自噬囊泡，紅色點代表自噬溶酶體；
G、H：AML-12 細胞經 β-SIT 預處理 24 h，并在有或無氯喹條件下檢測凈 LC3B-II 流；
I、J：BODIPY493/503 染色觀察有或無氯喹條件下脂滴聚集；
K、L：LAMP1 免疫熒光染色代表圖像及定量分析；
M：BODIPY493/503 標記脂滴，LysoTracker Red 標記溶酶體，采用多結構光照明顯微鏡拍攝明場和熒光圖像，并生成 3D 表面圖顯示熒光圖像；
N：多結構光照明顯微鏡對 β-SIT 干預 0、12、24 h 進行 7 min 時間延遲成像，顯示脂滴與溶酶體接觸的動態和瞬時特征。
比例尺：10 μm，局部放大圖 1 或 5 μm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示無顯著差異。

4. β-SIT 通過恢復脂滴自噬活性，改善 MASH 小鼠肝臟脂質蓄積

為研究 β-SIT 在體內對脂滴自噬的影響，研究在 CDAHFD 喂養小鼠中進行了系統分析。與模型組相比，β-SIT 顯著增強自噬和溶酶體生物發生，表現為自噬標志物 LC3B-II、溶酶體標志物 LAMP1 表達升高，p62 表達降低。

同時，β-SIT 明顯降低肝組織 PLIN2 蛋白表達，并增強 LAMP1 熒光信號，二者共定位增加，提示脂滴自噬被強烈激活。透射電鏡顯示，CDAHFD 模型小鼠肝組織中脂滴增大，自噬體無法與溶酶體融合，提示自噬溶酶體形成受阻；而 β-SIT 處理可促進自噬體包裹脂滴，并通過自噬溶酶體形成促進脂滴降解。與 CDAHFD 模型一致，在 HFD 模型中，β-SIT 同樣可調控自噬并激活自噬溶酶體形成。

為確認 β-SIT 的肝保護作用確實依賴自噬機制，研究使用氯喹處理小鼠建立自噬缺陷環境。結果顯示，氯喹阻斷了 β-SIT 在 CDAHFD 小鼠中的降脂作用，并逆轉了 β-SIT 促進 PLIN2 與 LAMP1 共定位的效果，削弱脂滴自噬激活。以上結果證明，β-SIT 對 MASH 的保護作用依賴自噬介導的脂滴自噬調控。

圖4 β-SIT 通過激活脂滴自噬改善 MASH 小鼠脂肪變性。
A：CDAHFD 誘導 MASH 模型小鼠不同組肝組織中 LC3B、p62 和 LAMP1 蛋白表達變化；
B：肝組織切片中 PLIN2（綠色）和 LAMP1（紅色）的雙重免疫熒光，黃色區域表示熒光共定位，DAPI 復染細胞核；
C：小鼠肝組織透射電鏡圖像。黃色代表溶酶體，紅色代表自噬溶酶體，綠色代表自噬囊泡，藍色代表脂滴；
D：研究設計。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型并給予高劑量 β-SIT（20 mg/kg）干預，氯喹從第 6 周開始腹腔注射，第 10 周分析；
E：小鼠肝組織 H&E 染色和油紅 O 染色；
F：肝臟 TG 含量；
G：肝組織中 PLIN2（綠色）和 LAMP1（紅色）的雙重免疫熒光。
比例尺：50 μm，局部放大圖 20 μm；透射電鏡比例尺：1 μm，局部放大圖 200 nm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示無顯著差異。

5. β-SIT 在體外通過靶向 RAC1 促進脂滴自噬

為進一步探討 β-SIT 如何通過調節脂滴自噬促進脂解，研究首先通過多數據庫綜合生物信息學分析篩選潛在分子靶點。研究整合三個 MASH GEO 數據集，共包括 46 個 MASH 樣本和 45 個對照樣本，并識別出 909 個差異表達基因。隨后，將這些差異基因與 232 個自噬相關基因交叉分析，得到 13 個重疊基因，并通過 LASSO 回歸篩選出 11 個關鍵診斷基因。ROC 曲線分析顯示這些基因具有較好的判別能力。

隨后，研究整合 Batman、SuperPred、Swiss Target Prediction 和 PharmMapper 數據庫預測 β-SIT 潛在靶點，并與 11 個關鍵診斷基因取交集，最終確定 RAC1 是 β-SIT 通過自噬調控 MASH 的預測靶點。分子對接顯示，β-SIT 與 RAC1 的結合能為 ?7.5 kcal/mol，提示二者具有較強相互作用。分子動力學模擬進一步顯示 β-SIT-RAC1 復合物逐漸穩定，形成穩定結合構象。細胞熱轉變實驗顯示，β-SIT 可提高 RAC1 在 37–70°C 范圍內的熱穩定性，進一步證實 RAC1 是 β-SIT 的直接靶點。Western blot 結果顯示，β-SIT 可顯著抑制 FFA 誘導的 RAC1 蛋白上調。

由于抑制 mTOR 通路是激活自噬的經典機制，且 RAC1 抑制可調控 mTOR 信號增強自噬，研究進一步探討 β-SIT 是否通過 RAC1-mTOR 通路調節自噬流和脂滴自噬。結果顯示，β-SIT 顯著降低 FFA 誘導 AML-12 細胞中 RAC1 和 p-mTOR 蛋白表達，提示 β-SIT 可能通過下調 RAC1 抑制 mTOR 通路激活。

為驗證 RAC1 在脂滴自噬中的調控作用及其是否參與 β-SIT 增強自噬流、減輕脂質沉積，研究在 AML-12 細胞中進行 RAC1 過表達和敲低?；A狀態下，RAC1 過表達促進細胞脂質蓄積并阻斷自噬流，提示 RAC1 過表達會損害脂滴自噬清除。FFA 條件下，RAC1 過表達抑制 LC3B-II 表達，上調 PLIN2、p62 和 p-mTOR，說明 RAC1 過表達通過激活 mTOR 通路抑制自噬溶酶體形成，最終導致脂滴蓄積和代謝紊亂。

相反，RAC1 敲低可強效抑制 mTOR 通路活性，促進自噬流并恢復脂質穩態。β-SIT 可降低 RAC1 蛋白水平并抑制 mTOR 磷酸化，同時激活脂滴自噬，表現為 LC3B-II 上調、p62 和 PLIN2 下調；這些作用在 RAC1 過表達細胞中明顯減弱，而在 RAC1 敲低細胞中進一步增強。

油紅 O 染色、細胞 TG 含量和 mCherry-eGFP-LC3B 實驗結果均顯示，β-SIT 可顯著增強自噬流、減少脂滴蓄積和溶酶體損傷；RAC1 過表達阻斷 β-SIT 的保護作用，導致自噬流形成受阻和脂質蓄積；RAC1 敲低則增強 β-SIT 的作用。溶酶體和脂滴定位分析顯示，β-SIT 可增強脂滴與溶酶體共定位，促進溶酶體包裹脂滴；RAC1 過表達抑制這種共定位并削弱 β-SIT 療效，而 RAC1 敲低增強該作用。

綜上，β-SIT 可調控 RAC1-mTOR-自噬軸，通過增強自噬體形成和促進溶酶體生物發生兩個連續機制激活脂滴自噬，從而改善脂質代謝紊亂。

圖5 β-SIT 通過調控 RAC1 表達調節脂滴自噬。
A：Venn 圖顯示 MASH 疾病差異相關基因、β-SIT 預測靶點和自噬數據庫共有重疊基因；
B：β-SIT 與 RAC1 的分子對接，結合能 = ?7.5 kcal/mol；
C：分子動力學模擬中 β-SIT-RAC1 復合物 RMSD 值變化及可視化結果；
D：肝細胞中 RAC1 的細胞熱轉變實驗；
E：Western blot 檢測 β-SIT 誘導的 RAC1、mTOR 和 p-mTOR 蛋白表達變化；
F：AML-12 細胞轉染 oeRAC1 或 oeCon 后，經 FFA 和 β-SIT 處理 24 h，檢測 p62、LC3B、PLIN2、mTOR、p-mTOR 和 RAC1 蛋白；
G、H：Vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 組油紅 O 染色及陽性面積定量；
I：細胞內 TG 含量；
J、K：轉染 mCherry-GFP-LC3B 質粒后，在有或無 vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 條件下分析自噬流；黃色點表示自噬囊泡，紅色點表示自噬溶酶體；
L：脂滴和溶酶體分別用 BODIPY493/503 和 LysoTracker Red 標記，并在有或無 β-SIT 處理下觀察 vehicle、oeRAC1 和 siRAC1 組。
比例尺：10 或 20 μm，局部放大圖 1 或 5 μm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01；n.s. 表示無顯著差異。

6. β-SIT 在體內通過靶向 RAC1 促進脂滴自噬

基于細胞實驗結果，研究進一步評估 β-SIT 是否在小鼠中通過靶向 RAC1 促進脂滴自噬來減輕 MASH。Western blot 顯示，CDAHFD 和 HFD 誘導小鼠中 RAC1 蛋白表達均上調，并伴隨 mTOR 通路激活，而 β-SIT 可顯著逆轉這一變化。

為驗證 RAC1 的關鍵作用，研究采用尾靜脈注射 AAV8-RAC1，在正常飲食和 CDAHFD 小鼠中誘導肝臟 RAC1 過表達。正常飲食小鼠中，肝臟 RAC1 過表達并未導致明顯肝損傷，但油紅 O 染色顯示出現輕度脂滴蓄積，Western blot 進一步提示該表型可能與自噬受損有關。

在 CDAHFD 小鼠中，肝組織 TG 檢測和血脂分析顯示，RAC1 過表達顯著抑制 β-SIT 改善血脂異常和降低肝臟 TG 的治療作用。肝臟大體形態、H&E 染色、油紅 O 染色、Masson 染色和 F4/80 免疫熒光結果顯示，RAC1 過表達進一步加重 CDAHFD 誘導的肝脂肪變性，導致細胞腫脹、壞死以及肝內脂滴體積和數量增加，并顯著削弱 β-SIT 療效。

透射電鏡顯示，RAC1 過表達小鼠肝臟中脂滴更大，自噬體形成受損，自噬溶酶體缺失，導致脂滴堆積；β-SIT 可促進溶酶體生物合成和脂滴自噬，但其促進自噬溶酶體形成及吞噬脂滴的作用被 RAC1 過表達削弱。免疫熒光共定位和 Western blot 進一步證實，β-SIT 誘導自噬溶酶體吞噬脂滴的作用受到 RAC1 過表達明顯抑制。與此同時，RAC1 過表達也拮抗 β-SIT 下調 p-mTOR 和激活經典自噬通路的作用。

總之，β-SIT 通過激活脂滴自噬改善 MASH 的治療作用高度依賴 RAC1，說明 RAC1 是關鍵治療靶點。

圖6 肝臟 RAC1 過表達可逆轉 β-SIT 對 MASH 的改善作用。
A–D：CDAHFD 和 HFD 誘導的 MASH 小鼠模型中，β-SIT 處理后 RAC1、mTOR 和 p-mTOR 蛋白表達變化；
E：研究設計。采用 CDAHFD 建立 MASH 模型，并注射 AAV8-RAC1 腺相關病毒進行過表達，持續 10 周；
F：小鼠肝臟 TG 含量；
G：小鼠血清 TG 和 TC 水平；
H–L：小鼠肝臟大體形態、H&E 染色、油紅 O 染色、Masson 染色和 F4/80 陽性免疫熒光，以及 NAS 評分和組織學評價；
M：小鼠肝組織透射電鏡代表圖像。黃色代表溶酶體，紅色代表自噬溶酶體，綠色代表自噬囊泡，藍色代表脂滴；
N：肝組織切片中 PLIN2（綠色）和 LAMP1（紅色）的雙重免疫熒光；
O、P：RAC1 過表達對 β-SIT 處理 MASH 小鼠蛋白水平的影響，包括 LC3B、p62、LAMP1、PLIN2、RAC1、mTOR 和 p-mTOR。
比例尺：50 μm，局部放大圖 20 μm；肝臟比例尺：1 cm；透射電鏡比例尺：1 μm，局部放大圖 200 nm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示無顯著差異。

7. β-SIT 通過破壞溶酶體上 RAC1-mTOR 相互作用調節溶酶體功能

mTOR 激活可從多個層面抑制自噬溶酶體功能，包括負向調控自噬起始、損害溶酶體生物發生，以及破壞自噬體-溶酶體融合。為深入理解 β-SIT 調節自噬溶酶體功能的作用，研究進一步探索 β-SIT 對溶酶體內 RAC1 和 mTOR 相互作用及定位的影響。

共免疫沉淀實驗顯示，FFA 處理促進 AML-12 細胞中 RAC1 與 mTOR 結合，而 β-SIT 顯著減弱這種相互作用。免疫熒光分析進一步證實，FFA 誘導細胞中 RAC1 與 mTOR 共定位顯著增強，而 β-SIT 可明顯破壞二者共定位。因此，研究推測 β-SIT 可通過抑制 RAC1 和 mTOR 共定位來促進自噬及相關溶酶體功能。

mTORC1 定位于溶酶體膜上，直接調控溶酶體功能。既往研究顯示，抑制 RAC1 與 mTOR 在溶酶體膜上的共定位，可促進溶酶體和自噬體合成，從而激活自噬。免疫熒光結果顯示，FFA 誘導促進 RAC1 與溶酶體標志物 LAMP1 共定位，并削弱溶酶體對脂滴的包裹，導致脂滴降解減少和異常蓄積。β-SIT 處理則減少 FFA 誘導的 RAC1 與 LAMP1 共定位，同時激活溶酶體生成，增加能夠包裹脂滴的溶酶體數量，從而促進脂滴降解。

三維重建結果與二維成像一致，進一步證實 β-SIT 可在空間上使 RAC1 從溶酶體上解離，使溶酶體能夠更好地與脂滴接觸。研究分離溶酶體組分后發現，RAC1 可定位于溶酶體；β-SIT 可降低溶酶體中 RAC1 水平，而 RAC1 過表達可拮抗 β-SIT 作用。溶酶體中 p-mTOR 含量變化與 RAC1 完全一致：β-SIT 抑制 p-mTOR 在溶酶體中的定位，而 RAC1 過表達可逆轉這一現象。

總體而言，FFA 誘導的脂質紊亂模型中，溶酶體內 RAC1 與 mTOR 相互作用顯著增強；β-SIT 可抑制二者在溶酶體中的相互作用，從而激活溶酶體生物發生，促進自噬溶酶體合成和脂滴吞噬。這一機制凸顯了 β-SIT 解決 MASH 相關脂質蓄積的治療潛力。

圖7 β-SIT 通過抑制 RAC1 與 mTOR 在溶酶體上的共定位調節溶酶體功能。
A：AML-12 細胞經 FFA 和 β-SIT 處理 24 h 后，細胞裂解液進行 RAC1 抗體共免疫沉淀，并通過 Western blot 檢測 mTOR 和 RAC1，以驗證 RAC1 與 mTOR 的相互作用；
B：FFA 誘導 24 h 后，AML-12 細胞在有或無 β-SIT 處理下進行 RAC1（紅色）和 mTOR（綠色）免疫熒光染色，并用多結構光照明顯微鏡分析，共定位顯示為黃色；
C：代表性免疫熒光共染圖。左圖顯示 RAC1（綠色）、LAMP1（紅色）、脂滴 BODIPY493/503（亮藍色）和 DAPI（藍色）；中圖顯示 LAMP1 與脂滴共定位；右圖顯示 LAMP1 與 RAC1 定位；
D：超分辨率 z-stack 圖像的三維表面模型重建，顯示 LAMP1 標記溶酶體（紅色）、脂滴（亮藍色）和 RAC1（綠色）。白色箭頭表示 RAC1-LAMP1 共定位但與脂滴分離，粉色箭頭表示 LAMP1-脂滴關聯但與 RAC1 分離；
E：采用溶酶體分離試劑盒從 AML-12 細胞分離溶酶體，檢測全細胞裂解液和溶酶體裂解液中 RAC1、LAMP1、β-actin 和 Histone H3 水平；
F、G：AML-12 細胞轉染空載體或 RAC1 過表達質粒后，經 FFA 及有或無 β-SIT 處理 24 h，提取溶酶體并檢測 RAC1、mTOR、p-mTOR 和 LAMP1 水平。
比例尺：10 μm，局部放大圖 1 或 2 μm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01；n.s. 表示無顯著差異。

8. β-SIT 通過調節 RAC1-mTOR 通路促進 TFEB 核轉位

TFEB 是調控溶酶體生物發生和自噬的關鍵轉錄因子，在促進脂滴自噬和維持細胞內脂質穩態方面發揮重要作用。抑制溶酶體上 mTORC1 激活可促進 TFEB 核轉位，從而啟動自噬溶酶體生物合成及自噬相關基因表達。

為探討 β-SIT 是否通過經典 RAC1-mTOR 通路調控 TFEB 核轉位，研究觀察了 TFEB 的亞細胞定位。在 FFA 處理肝細胞中，核內 TFEB 及其下游靶點 ATP6V1A、PGC1α 的表達水平均下降，而 β-SIT 可逆轉這些變化，提示 β-SIT 可恢復 TFEB 活性。免疫熒光結果也顯示，β-SIT 顯著促進 FFA 處理肝細胞中 TFEB 入核。

為進一步明確 RAC1、mTOR 和 TFEB 之間的調控關系，研究檢測了 RAC1 過表達和 mTOR 沉默對 TFEB 的影響。結果顯示，RAC1 過表達導致核內 TFEB 蛋白表達下降，而 mTOR 沉默可逆轉這一變化。RAC1 過表達抑制 TFEB 入核，而 mTOR 沉默顯著增強 TFEB 核轉位。

隨后，為探究 β-SIT 在 RAC1-mTOR-TFEB 調控中的具體作用，研究在 AML-12 細胞中敲低 TFEB。Western blot 顯示，TFEB 敲低顯著降低 ATP6V1A、PGC1α 和 LAMP1 等溶酶體相關蛋白表達。并且，TFEB 敲低明顯抑制 β-SIT 介導的自噬流增強，以及溶酶體與脂滴共定位促進作用。

綜上，β-SIT 通過調控 RAC1-mTOR-TFEB 通路促進溶酶體生物發生和脂滴自噬，從而減少肝臟脂質蓄積。

圖8 β-SIT 通過調節 RAC1-mTOR 通路促進 TFEB 核轉位。
A：Western blot 檢測核內 TFEB 蛋白水平，以及 ATP6V1A 和 PGC1α 蛋白水平；
B：采用多結構光照明顯微鏡評估 FFA 處理且有或無 β-SIT 干預的 AML-12 細胞中 TFEB 核定位；
C、D：RAC1 過表達和 mTOR 沉默處理后，檢測核內 TFEB 蛋白水平及 TFEB 定位；
E：AML-12 細胞轉染 siTFEB 或 siCon 后，經 FFA 和 β-SIT 處理 24 h，檢測核內 TFEB 以及細胞內 LAMP1、PGC1α 和 ATP6V1A 蛋白水平；
F、G：AML-12 細胞轉染 mCherry-GFP-LC3B 質粒評估自噬流，并展示代表性圖像。黃色點表示自噬囊泡，紅色點表示自噬溶酶體；黑色箭頭表示溶酶體，紅色箭頭表示脂滴；
H：BODIPY493/503 標記脂滴，LysoTracker Red 標記溶酶體，采用多結構光照明顯微鏡獲取熒光圖像，并生成 3D 表面圖。
比例尺：10 μm，局部放大圖 1 或 5 μm。數據以均數 ± SEM 表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n.s. 表示無顯著差異。

【Citation】:Wang Y, Sun Y, Wang CY, et al. β-Sitosterol ameliorates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by targeting the RAC1/mTOR/TFEB axis thus activating lipophagy-lysosomal pathway.Acta Pharmacol Sin.2026;47(4):946-963.

【貢獻】★★★★★

本研究證明，β-SIT 可在體外 FFA 刺激的 AML-12 和 HepG2 細胞模型，以及體內 CDAHFD 或 HFD 誘導的小鼠模型中，通過靶向 RAC1 抑制下游 mTOR 通路激活，并促進 TFEB 核轉位，從而恢復脂滴自噬功能。

進一步地，β-SIT 可通過解離溶酶體上的 RAC1-mTOR 復合物，促進溶酶體生物發生和自噬溶酶體形成，進而減輕肝臟脂質蓄積。

這些發現表明，β-SIT 可通過調控 RAC1-mTOR-TFEB 軸 發揮改善 MASH 的作用，為 MASH 治療提供了一種新的潛在策略。

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