Hans Clevers教授講述開發首個類器官背后的故事：放下預設、用心觀察、大膽求證

翻譯丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

2009年，Hans Clevers等人使用來自小鼠腸道的成體干細胞培育出首個腸道類器官，開創了類器官研究時代。

2026 年 5 月 7 日，Hans Clevers 在Cell Stem Cell期刊發表了題為：How ever-expanding organoids from epithelial stem cells were developed: A hypothesis-free approach 的文章，講述了開發首個類器官的背后的故事。

我的實驗室最初并不是為了研究腸道而設立的。我們始于免疫學，嘗試理解 T 細胞發育的轉錄調控。那項工作引領我們定義了 Tcf 轉錄因子家族，并最終認識到它們是 Wnt 信號通路的核效應物。一個決定性的轉折點出現在 Tcf4 基因敲除小鼠展示出顯著表型時。它們未能建立腸道干細胞的區域——利貝昆隱窩（crypts of Lieberkuhn）。在深入研讀腸道生物學后，我們了解到這些隱窩完成了一項相當不可思議的壯舉：它們在生命的每一周都會替換掉整個腸道內壁的上皮層，這是哺乳動物任何實體組織中最快的自我更新過程。我們被這背后的生物學所吸引，并成功地將自己從一個免疫學實驗室轉變為一個腸道研究實驗室。

我們當時的信念是，Wnt 通路（特別是其在腸道中的靶基因）可以提供工具來識別這些神秘的干細胞。生理性的 Wnt 信號驅動著腸道干細胞，而我們也曾在與Bert Vogelstein的合作中發現，該信號通路的突變激活會導致癌癥。這聽起來像是同一枚硬幣的兩面。如果我們能定義人類結腸癌中的 Wnt 靶基因程序，這可能啟發一種識別健康腸道干細胞的實驗方法。

我實驗室的一名成員，Marc van de Wetering，構建了可以誘導阻斷 Wnt 通路的結腸癌細胞系。理論上，這將允許他通過比較誘導前后轉錄組來獲得一個 Wnt 靶基因列表。然而，在九十年代末，小鼠或人類的基因組序列尚未被破譯。流行的方法（例如差異顯示）在我們手中沒有奏效。大約在 2000 年，斯坦福大學的 Pat Brown 發明的基因微陣列技術成為了救星。一位荷蘭合作者 Cor Verweij 當時恰好在 Pat Brown 的實驗室進行學術休假，設法搞到了兩塊微陣列芯片。Cor Verweij詢問在 Marc van de Wetering 的結直腸癌細胞系中抑制 Wnt 后哪些基因表達下調。在阻斷 Wnt 通路后的兩個時間點分離 mRNA，從未誘導樣本制備的 cDNA 和誘導后的 cDNA 樣本用不同顏色標記，混合后與一個包含大約 24000 個 cDNA 條目的 DNA 微陣列雜交。一個腸道內 Wnt 基因的候選名單由此誕生。

與此同時，我所在的醫院在各部門和董事會之間增加了一層額外的官僚機構。作為部門負責人，我發現自己陷入了一個不斷擴張的卡夫卡式的管理者世界。2002 年，我辭去職務，并將整個實驗室搬到了街對面的 Hubrecht 研究所，這是一個擁有百年歷史的胚胎學研究所，以 Pieter Nieuwkoop（發育生物學奠基人之一）在青蛙發育方面的工作而聞名于世。這被證明是一個絕佳的舉措。

在 Hubrecht 研究所的新大樓安頓下來后，我們孜孜不倦地研究這個候選基因列表，仔細查看表達模式，并為有希望的候選基因創建轉基因小鼠模型。這最終引導了英國博士后 Nick Barker 鑒定出Lgr5是隱窩基底微小細胞的標志物，這些細胞規則地散布在體積大得多的潘氏細胞之間。Nick Barker 實驗的關鍵是培育了一種基因敲入小鼠，它從 Lgr5 位點共表達綠色熒光蛋白（GFP）和他莫昔芬誘導版本的 Cre 重組酶。GFP 使得這些微小細胞能被觀察到，而通過 Cre 酶進行的譜系追蹤則為它們的長時期干性提供了確鑿證據。Lgr5+ 干細胞后來被證明有很多令人驚訝的特性。當時，人們普遍認為干細胞很少分裂。然而，Lgr5+ 細胞卻持續不斷地進行細胞周期，細胞分裂時間不到一天。這一觀察激發了幾次嘗試，試圖在器官芯片形式中培養上皮碎片和分離的隱窩。這些努力都失敗了。實驗室成員并不感到意外，因為當時普遍認為正常細胞無法在培養中長期存活，更不用說增殖了。當時認為，只有癌細胞才能做到。

在此期間，Marc van de Wetering 學會了如何從 Nick Barker 的小鼠模型中流式分選出脆弱的 Lgr5-GFP+ 細胞。來自日本的 Toshiro Sato 隨后以博士后身份加入我的實驗室。Toshiro Sato 在東京攻讀博士學位期間曾嘗試在 2D 培養中培養隱窩，他是實驗室里唯一一個想再試一次的人。我們接下來制定了一個計劃。目標是從幾個分選出的干細胞開始，使用確定的生長因子來擴增它們的數量。我聽到 Wnt 領域的開創者 Roel Nusse 在一次報告中提到，他實驗室的博士后 Arial Zheng 試圖在培養中擴增小鼠乳腺上皮細胞。Roel Nusse 強調，將 Wnt 激活與酪氨酸激酶受體（例如 EGFR 或 HER2）的激活結合起來是關鍵。

上皮生長因子（EGF）早在 20 世紀 80 年代就已被確認為隱窩的促有絲分裂因子，并且可以商業化獲取。激活 Wnt 則更為復雜。Roel Nusse 已經證明，分泌型的 Wnt 蛋白經過脂質修飾，這使它們溶解度低且難以生產。穩定轉染 Wnt3A 的細胞培養上清液可以適度激活 Wnt 信號，但必須以 1:1 的比例與新鮮培養基混合使用，而且它含有 10% 的血清。血清后來被證明對隱窩細胞是致命的。在尋找激活 Wnt 通路替代方法的過程中，我們轉向了 Rspondin 蛋白。Niers 和 Wu 在非洲爪蟾篩選中將其中一種 Rspondin 鑒定為 Wnt 信號的放大器。與此同時，日本釀酒公司麒麟（Kirin）一直在資助一家位于美國加州的生物技術公司 Nuvelo，進行轉基因小鼠篩選，以發現分泌蛋白的新功能。他們的蛋白之一，Rspondin1，產生了一種腸道上皮細胞高度增生的小鼠。為了開發 Rspondin1 用于再生目的，Nuvelo 已啟動一期臨床試驗。當我們與他們的一位科學家 Ari Abo 交談時，發現 Nuvelo 即將關閉。Ari Abo 與我們分享了大量剩余的臨床級 Rspondin1。盡管當時 Rspondin 的作用機制尚未闡明，但決定使用 Rspondin 而非 Wnt 條件培養基被證明是幸運之舉。

在 Nick Barker 鑒定腸道干細胞的項目之外，我們一直在轉基因小鼠中操縱信號通路，以確定允許隱窩微環境支持其持續自我更新的生長因子環境。我們相當隨機地關注了包括 Notch 和 BMP 在內的通路。雖然 Notch 通路產生了顯著的表型，但這些似乎與干細胞下游的命運決定有關。探究 BMP 通路的靈感來源于 Brigid Hogan 在探討 BMP 信號在皮膚毛囊模式形成中的作用時，使用了轉基因 Noggin 等位基因。Noggin 是一種 BMP 因子的分泌型抑制劑。Ana Haramis 構建了一種在腸道上皮中表達 Noggin 的轉基因小鼠。這些小鼠表現出強烈但非常奇特的表現：我們注意到沿著絨毛長度出現了許多小型隱窩。這些迷你隱窩又產生了它們自己的微小絨毛，形成了令人困惑的迷宮樣結構。我們得出結論，BMP 的抑制創造了一個“允許隱窩形成”的環境（當時暫時沒有更好的描述）。隨后，我們的病理學家 Johan Offerhaus 指出，這些病變與在患有幼年性息肉病（一種由 BMP 通路成分功能喪失突變引起的遺傳綜合征）的兒童身上看到的病變極為相似。Noggin 顯然是需要添加到 Toshiro Sato 的培養基組合中的一個候選因子。我們努力嘗試了包含三種因子的組合：EGF、Rspondin 和 Noggin。然而，還是沒有生長。

我在一次研討會的茶歇中遇到了 Mina Bissell，并向她征求對 Toshiro Sato 項目的建議。她簡單地回答：Matrigel（基質膠）。基質膠是一種神奇但成分不明確的細胞外基質樣提取物，它是從在小鼠腹腔中生長的 EHS 肉瘤細胞中純化出來的。

確實，當 Toshiro Sato 將他的干細胞嵌入一小滴基質膠中，在 37°C 下使其形成水凝膠，然后在無血清條件下加入三因子組合時，他觀察到了從原代隱窩（后來甚至是單個Lgr5+ 干細胞）開始的驚人擴增。但并非預期的干細胞團，而是出現了獨特的結構：封閉的上皮囊性結構，帶有出芽。顯微鏡觀察顯示，這些芽重現了隱窩的關鍵特征，在基部有干細胞和潘氏細胞。中央的管腔包含了其他主要細胞類型：杯狀細胞、腸上皮細胞和產生激素的腸內分泌細胞，它們都完全分化，并且其基底側位于 Toshiro Sato 后來所稱的“迷你腸道”的外側。這些結構可以無限期地擴增，沒有表現出預期的端粒縮短、衰老、增殖耗竭或惡性轉化。事實上，來自單個 Lgr5+ 干細胞的類器官后代可以被移植到多只小鼠體內，產生持續存在的健康上皮斑塊。

偶然獲得了大量的 Rspondin1，被證明是多方面的福音。首先，高濃度的 Rspondin 在類器官培養中是必需的。如果不是 Nuvelo 捐贈了他們的臨床批次，我們很可能永遠無法添加所需的量。其次，我們在很久以后才發現 Lgr5 是 Rspondin 的受體；其作用機制現在已得到充分理解。第三，小鼠潘氏細胞產生 Wnt3 并在其周圍形成一個陡峭的 Wnt 信號梯度。添加的 Rspondin1 會放大 Wnt 信號強度，但保持這種局部梯度，這就是為什么小鼠小腸類器官始終包含緊鄰其 Wnt 源（潘氏細胞）的活躍分裂的干細胞。在更遠端，Wnt 信號較弱，允許祖細胞分化為其他任何細胞類型。如果我們當時用人腸隱窩（其中潘氏細胞不產生 Wnt）做實驗，就不得不結合使用 Wnt3A 和 Rspondin。那樣將不會出現對稱性破缺的 Wnt 梯度，而是普遍存在的強 Wnt 信號：我們可能會得到一團沒有任何有趣特征的祖細胞球，然后我們很可能就轉向下一個項目了。

自從這些關于上皮類器官培養的最初實驗以來，人們學到了很多。培養不一定必須從純化的干細胞開始；小的組織碎片通常就足夠了。甚至可以從尿液（膀胱或腎臟）或痰液（氣道）中培養出類器官。經過優化生長因子組合（即使不是全部），大多數上皮類型都可以被培養。這些組合無一例外地做三件事：它們強烈激活 Wnt，激活組織相關的酪氨酸激酶受體（例如 EGF、FGF 和 HGF），并抑制 BMP/TGF-β 信號。通常還需要額外的生長因子或激素。而基質膠仍然是提供必要細胞外基質信號的神奇成分。

自 Toshiro Sato 在 2009 年首次描述基于組織干細胞的類器官培養以來，實驗室一直在追求廣泛應用的原理驗證，并已擴展到許多其他器官類型的生物學現象和疾病研究。在此期間，我曾擔任荷蘭皇家科學院院長數年，這是一個媒體曝光度很高的角色。隨后，我共同創立了荷蘭首家專門治療兒童癌癥的醫院，一個非常特別的地方，叫做瑪克西瑪公主中心（Princess Maxima Center）。在過去的 7 年里，我一直在瑞士一家跨國制藥公司羅氏制藥擔任董事會成員。這是三個截然不同但都令人著迷的角色。

自從大約 50 年前我第一次踏入實驗室以來，實驗室的工作臺一直是我日常的錨點。一路走來，我學到了很多東西，但有一點尤為突出：不要試圖智勝大自然（don’t try to outwit Nature）。在研究一個生物學問題時，不要通過提出一個假設來讓自己帶有偏見。你總會是錯的。大自然終將揭示她的秘密，但前提是你要保持作為一個思想開放的觀察者，并有勇氣遵循大自然的指引，即使這會讓你感到不適。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(26)00141-4