APSB I 光馭囊泡，針達心?。壕G光重編程細胞外囊泡開啟心梗修復新策略 (蔡本志/楊寶峰/潘振偉哈爾濱醫科大學)

2026年3月3日，哈爾濱醫科大學蔡本志、楊寶峰、潘振偉團隊在藥學領域權威期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1區，IF=14.6）在線發表題為 “Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism” 的研究論文。該研究聚焦心肌梗死后心肌修復過程中干細胞來源細胞外囊泡產量低、活性不足及局部滯留差等臨床轉化瓶頸，圍繞綠光光生物調節如何重編程人胚胎干細胞來源細胞外囊泡，并通過可降解水凝膠微針貼片實現梗死心肌精準、持續遞送展開系統研究。研究發現，綠光重編程后的細胞外囊泡富集miR-423-3p，可通過調控ZBTB7A/PKM2軸增強心肌細胞糖酵解代謝，促進心肌細胞增殖和血管新生，同時抑制心肌細胞凋亡，最終顯著改善心肌梗死后的心臟功能。該研究將光生物調節、細胞外囊泡工程和可降解微針遞送平臺有機結合，為缺血性心臟病的精準修復和再生治療提供了全新策略。

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【摘要】

干細胞衍生的細胞外囊泡（EVs）在心肌梗死（MI）的治療中具有巨大的潛力。然而，高效生產具有高生物活性的EVs仍然是限制其臨床轉化的關鍵瓶頸。在此，我們證明了在綠光條件下進行的光生物調節（PBM）能夠激活人類胚胎干細胞（hESCs），使其分泌更多具有卓越心肌保護活性的EVs。這些經PBM重編程的hESC-EVs通過促進心肌細胞增殖和血管生成，同時抑制細胞凋亡，改善了小鼠MI模型的心臟恢復情況。值得注意的是，我們驗證了這些EVs同樣能增強人類心肌細胞的存活和增殖，突顯了其臨床轉化潛力。進一步的分析揭示，這種益處歸因于重編程的hESC-EVs中含有較高的miR-423-3p，該物質通過調節ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解代謝并恢復線粒體功能。此外，我們合成了一種具有優越生物相容性、生物可降解性和機械強度的甲基丙烯酰水凝膠微針貼片，用于負載hESC-EVs，并通過改進的遞送裝置將該貼片輸送至梗死心臟。該系統確保了EVs向缺血心肌的精準和持續遞送，為MI提供了一種強有力的治療方法。總而言之，這種基于光學和生物材料的方法有效制備了具有更高心肌保護活性的EVs，為心臟疾病提供了新的治療策略。

(圖文摘要說明：綠光重編程的人類胚胎干細胞來源的細胞外囊泡（hESC-EVs），被封裝在三維GelMA微針中并通過真空輔助遞送，通過miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解，從而促進心臟修復。)

01

研究背景及科學問題

心肌梗死（MI）是全球發病率和死亡率的首要原因，對患者的健康和生活質量構成嚴重威脅。在MI的病理過程中，由于持續的缺血和缺氧損傷，大量功能性心肌細胞（CMs）發生壞死和凋亡。缺失的CMs隨后被纖維瘢痕組織替代，導致心室重塑、心臟功能下降，并最終引發心力衰竭。盡管在外科、介入和藥理學治療方面取得了顯著進展，但這些方法仍無法彌補MI后心肌細胞的丟失。幾十年來，基于干細胞的再生醫學為MI治療帶來了曙光。移植的干細胞通過肌力偶聯和旁分泌作用，促進心肌收縮和血管生成，從而改善心臟功能。胚胎干細胞（ESCs）是一種來源于人類囊胚內細胞團的多能細胞，已被探索用于多種疾病的細胞治療，包括年齡相關性黃斑變性、脊髓損傷和1型糖尿病。值得注意的是，ESCs由于其自我更新和分化能力，在心臟修復方面也具有巨大前景。然而，它們的臨床應用受到一些挑戰的限制，包括免疫排斥和致瘤性的顯著風險、不理想的生物分布與定植，以及倫理問題。

細胞外囊泡（EVs）是帶有脂質雙分子層的微小膜泡，攜帶著蛋白質、mRNA、非編碼RNA和脂質，是細胞間信息傳遞和物質交換的重要介質。源自干細胞的EVs已顯示出可觀的治療特性，且安全性問題較少，具有“現成可用”的便利性。最近的一項研究表明，由胚胎干細胞分泌的EVs（ESC-EVs）能有效改善衰老小鼠的年齡相關病理表型并挽救其轉錄組譜。此外，ESC-EVs還被證明具有一定的抗腫瘤特性。在Khan等人的研究中，發現小鼠ESC-EVs能增強新生血管形成和CM存活，同時減少纖維化，從而改善MI后的心臟功能。因此，基于EV的“無細胞”治療策略憑借其優越的生物相容性，可能成為臨床治療中ESCs的理想替代品。盡管如此，用于心臟修復的EV治療通常受到產量低、半衰期短和組織滯留性差等幾項挑戰的制約。為了達到治療效果，需要反復給藥，而多劑量的EV心內注射屬于高侵入性且耗時的手術。因此，許多研究開始致力于通過各種條件提升干細胞衍生EVs的治療效果。

光生物調節（PBM）是一種非侵入性療法，利用特定波長內低強度、生物相容的光線穿透組織并與細胞內的發色團相互作用。這種相互作用觸發一系列光物理和光化學事件，最終調節各種細胞和組織的命運。研究表明，PBM可以誘導多種積極的生物反應，包括增強細胞增殖、促進代謝過程和減輕炎癥反應。因此，這項技術已被廣泛應用于臨床以促進傷口愈合、緩解疼痛以及促進肌肉和神經組織的再生。值得注意的是，通過激光或發光二極管（LEDs）實施的PBM，也被認為是一種能夠有效調節干細胞生物學特征和功能的有力工具，且獨立于基因或藥物干預。然而，目前的研究主要集中在PBM對干細胞的直接細胞內作用。PBM是否會影響ESCs的分泌功能，從而改變其衍生EVs的組成和生物學功能，仍有待探索。此外，除了調節EVs的生物活性外，應用先進的遞送系統來增強EVs在損傷部位的滯留并實現持續釋放同樣至關重要。近年來，微針（MN）貼片已成為再生醫學中一種有前景的長期局部藥物遞送平臺。它們提供了微創的進入方式、對藥物釋放的時空控制以及改善的局部滯留性，已成功應用于糖尿病和慢性難治性傷口的修復。受這些進展的鼓舞，我們認為將這種功能平臺應用于心臟遞送可以克服直接注射EV進行心肌修復的局限性。

在本研究中，我們開發了一種用PBM處理人類胚胎干細胞（hESCs）并隨后分離其釋放的EVs的方案。我們的結果表明，波長為520 nm的光（綠光）進行PBM能夠刺激hESCs產生具有增強生物活性的EVs。這些EVs通過調節糖酵解代謝和線粒體穩態，促進了心肌細胞周期重新進入、抑制心肌細胞凋亡并促進血管生成，從而顯著恢復了MI后的心臟功能。此外，為了解決局部心肌內注射EVs后組織滯留率低的問題，我們制備了一種具有優異生物相容性、生物可降解性和機械強度的甲基丙烯酰明膠（GelMA）微針貼片，用于負載hESC-EVs，然后通過一種改良裝置將貼片附著在梗死心臟上。GelMA微針貼片通過實現hESC-EVs的靶向和持續釋放，增強了其對MI的治療功效?？偠灾?，我們的發現證明，這種基于光學和生物材料的方法可以有效制備具有更高心肌保護活性的EVs，用于治療缺血性心臟病。

02

重要發現及亮點

3.1 綠光介導的光生物調節增強了hESC-EVs的心肌保護活性

首先，我們通過超速離心從未經處理的H9-hESCs條件培養基中分離出hESC-EVs。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，hESC-EVs呈現典型的杯狀囊泡結構。同時，納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示其粒徑呈單峰鐘形分布，集中在100 nm左右，證實了hESC-EVs的成功純化。為了確定hESC-EVs對CMs的最佳干預劑量，我們使用CCK-8檢測評估了用不同濃度的hESC-EVs處理后CM的存活率。結果顯示hESC-EVs以劑量依賴的方式增強CM活力，在終濃度為$3\times10^9$ particles/mL時觀察到最顯著的作用，這被選為我們后續研究的濃度。隨后，為了評估PBM是否影響hESC-EVs的生物活性，我們將hESCs暴露在多種波長的光下，包括綠光（520 nm）、紅光（630 nm）、黃光（590 nm）和藍光（470 nm）。然后收集每個照射組的等量EVs用于處理CMs 48小時。結果顯示，與無光和其它波長光處理的組相比，在$2.5 mW/cm^2$的功率密度下暴露于綠光的hESCs所衍生的EVs顯著提高了CM的活力。為進一步確定最佳照射持續時間，我們評估了在不同持續時間的綠光照射下hESC-EVs的生物活性。CCK-8檢測顯示，與其它組的等量EVs相比，暴露于綠光30分鐘的hESCs衍生的EVs顯著提高了CM的活力。隨后的NTA顯示，EV的產量也在30分鐘時達到峰值。因此，選擇30分鐘的綠光照射（520 nm，$2.5 mW/cm^2$）來刺激我們后續實驗中的hESCs，這些經PBM重編程的hESC-EVs被命名為PbEE。

我們進一步表征了PbEE的形態。TEM和NTA均顯示PbEE展示出與對照hESC-EVs（CEE）相當的形態特征和粒徑分布。蛋白質印跡（Western blot）分析顯示，來自相同數量H9-hESCs的PbEE中EV標志物（Flotillin-1、TSG101、CD63）的水平高于CEE。在H1-hESCs中得到了高度一致的結果，進一步證實了綠光照射增強了hESCs的EV產量。為確定PbEE和CEE對CMs的生物活性，我們使用膜特異性熒光探針（EV-Tracker）標記這些EVs。孵育12小時后，在心肌細胞骨架中檢測到了EVs的紅色熒光信號。同樣，在CMs中也觀察到了來自GFP-CD63標記的EVs的綠色熒光，表明EVs被成功內化。隨后，用等量顆粒數的CEE或PbEE分別處理CMs 48小時。與CEE相比，PbEE顯著增加了CMs中增殖標志物EdU、Ki67和pH3的陽性率。此外，在缺氧條件下，與CEE相比，PbEE進一步減少了TUNEL陽性CMs的數量。在源自H1-hESCs的PbEE中進一步驗證了一致的結果。這些發現表明，在促進細胞周期激活和抑制CM凋亡方面，PbEE相比等量CEE具有更優越的生物活性。

圖1 綠光誘導人胚胎干細胞（hESCs）分泌具有增強心臟保護活性的細胞外囊泡（EVs）。

（A）光生物調節重編程hESC來源EVs（PbEE）的制備與提取流程。使用BioRender.com繪制。（B）PbEE和對照hESC來源EVs（CEE）的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像。比例尺：200 nm。（C）PbEE和CEE的納米顆粒追蹤分析（NTA）結果。（D，E）來源于等量H9-hESCs的EVs中Flotillin-1、TSG101和CD63的Western blot分析（n=4–5）。（F）EV-tracker標記的EVs（紅色）與新生小鼠心肌細胞共培養12 h后的內吞情況。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。比例尺：10 μm。（G–J）采用EdU、Ki67和pH3染色（紅色）評估等劑量CEE和PbEE處理后心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（3×10? particles/mL；n=6）。白色箭頭：陽性細胞。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（K，L）TUNEL染色（紅色）檢測心肌細胞凋亡的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.2 PbEE在體外表現出比CEE更強的促血管生成活性

鑒于血管生成在MI后心臟修復中的關鍵作用，我們進一步比較了PbEE和CEE對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的促血管生成作用。在與Tracker探針標記的EVs孵育6小時后，在HUVECs內觀察到明顯的紅色熒光信號，表明EV的內吞作用。然后，將HUVECs接種在涂有Matrigel的板上，并用等量的CEE和PbEE顆粒進行處理。值得注意的是，相比CEE處理，PbEE處理的HUVECs能夠形成更多的管狀網絡。一致地，傷口愈合試驗表明，CEE和PbEE均增強了HUVECs的遷移，而PbEE顯示出更優異的功效。這些發現表明，PbEE在體外比CEE具有更強的促血管生成潛力。

圖2 在心肌梗死（MI）小鼠中，PbEE較CEE表現出更強的心臟保護作用。
（A）體內實驗流程示意圖。使用BioRender.com繪制。ECHO：超聲心動圖。（B，C）MI后第28天的代表性超聲心動圖（B）及左心室射血分數（LVEF）和短軸縮短率（LVFS）的定量分析（C）。小鼠接受等劑量CEE或PbEE處理（3×101? particles；n=10）。（D，E）MI后第28天Masson三色染色代表性圖像及梗死面積定量分析（n=10）。比例尺：500 μm。（F，G）MI后第14天梗死邊緣區采用Ki67、pH3和Aurora B染色（紅色）評估心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：陽性心肌細胞；方框區域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（H）MI后第14天心肌細胞核型模式的代表性圖像及定量分析，包括單核心、雙核心和多核心心肌細胞比例（n=6）。比例尺：20 μm。（I）MI后第7天梗死邊緣區TUNEL陽性心肌細胞（紅色）的代表性圖像及定量分析（n=6）。方框區域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（J）MI后第28天梗死邊緣區CD31陽性毛細血管（綠色）的免疫熒光染色及定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：20 μm。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.3 PbEE對MI小鼠發揮更強的治療作用

為了評估CEE和PbEE在成年MI小鼠中的治療潛力，我們在誘導MI后通過心肌內注射給予了不同劑量的這些EVs（每只動物注射30 μL生理鹽水，含$1\times10^9$、$3\times10^{10}$和$9\times10^{11}$個顆粒）。在第28天對心臟功能的評估顯示，$3\times10^{10}$個顆粒在CEE和PbEE組中誘發了最顯著的功能改善，且PbEE在所有劑量下均表現出比CEE更優的療效?；诖?，$3\times10^{10}$顆粒/只被選定為進一步實驗的最佳濃度。組織學分析進一步表明，與CEE相比，PbEE治療導致梗死面積顯著減小。此外，PbEE治療減輕了MI誘導的心臟/體重比增加和CM橫截面積增大，表明PbEE對MI后的不良重塑具有更強的保護作用。

此外，免疫熒光染色顯示，與等量顆粒數的CEE相比，PbEE治療顯著增加了梗死心臟邊緣區Ki67、pH3和Aurora B陽性CMs的數量。PbEE也顯著提高了成人CMs的總數以及單核CMs的比例。在CEE或PbEE治療后，沒有觀察到對遠端區域的CM增殖有顯著影響。與體外在NMCMs中獲得的結果一致，PbEE治療顯著減少了邊緣區的凋亡CMs（相對于CEE）。此外，雖然CEE和PbEE都增強了血管生成，但PbEE表現出比等量CEE更大的促血管生成效果。綜合而言，這些結果表明PbEE通過促進CM增殖、抑制CM凋亡并刺激血管生成，在對抗缺血損傷方面具有更強的心肌保護作用。

圖3 miR-423-3p介導PbEE的心臟保護作用。
（A）Pandora測序流程示意圖。使用BioRender.com繪制。（B，C）PbEE和CEE之間差異表達小非編碼RNA（sncRNAs）的熱圖和火山圖。紅色：上調；藍色：下調（n=3）。（D）采用qRT-PCR檢測PbEE和CEE中sncRNAs的表達（n=4）。（E，F）采用EdU、Ki67和pH3染色評估心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：陽性心肌細胞。比例尺：20 μm。（G，H）antagomir-miR-423-3p轉染48 h后，人胚胎干細胞（hESCs）及其來源細胞外囊泡（hESC-EVs）中miR-423-3p水平（n=6）。（I，J）低氧24 h條件下，經PbEE、PbEE-NC或PbEE-antago-miR-423-3p（PbEE-anta）處理后心肌細胞凋亡的代表性圖像及凋亡指數（n=6）。比例尺：50 μm。（K–N）低氧心肌細胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax的Western blot分析（n=5）。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.4 PbEE通過miR-423-3p發揮心肌保護作用

眾所周知，EVs中豐富的小非編碼RNA（sncRNAs）在介導細胞內活動和細胞間通訊中起著關鍵作用。為了進一步探索PbEE發揮治療作用的分子機制，我們通過PANDORA-seq分析了同等顆粒數的CEE和PbEE之間包括miRNA、piRNA、tsRNA、rsRNA和snoRNA在內的sncRNA表達譜差異。結果顯示，與CEE相比，PbEE組中有11種sncRNAs顯著增加，7種sncRNAs顯著減少（P<0.05）。在這些上調的sncRNAs中，根據倍數變化值≥2篩選出4種高度差異表達的sncRNAs（hsa-miR-423-3p、hsa-let-7b-5p、piR-hsa-440814和hsa-miR-30d-5p）。為了驗證測序結果，我們進一步使用qRT-PCR檢測了這4種sncRNAs在兩組EVs中的表達。結果顯示，PbEE中miR-423-3p的表達顯著高于CEE。此外，我們還檢測了hESCs中miR-423-3p的表達，結果表明與未處理的hESCs相比，暴露于綠光的hESCs中miR-423-3p的水平顯著升高。因此，綠光照射能夠上調hESCs及其衍生EVs中miR-423-3p的表達。

隨后，我們檢測了在等量CEE和PbEE顆粒處理下的CMs中miR-423-3p的表達。結果顯示，與CEE組相比，PbEE處理顯著上調了CMs中miR-423-3p的表達。此前的研究表明，在多個物種中高度保守的miR-423-3p介導肝細胞癌和胃癌中的細胞生長。然而，miR-423-3p是否參與MI后CM增殖和心臟再生尚不清楚。為了進一步確定miR-423-3p在PbEE介導的心臟保護中的潛在作用，我們在綠光暴露后使用antagomir（拮抗劑）抑制hESCs中miR-423-3p的表達。qRT-PCR檢測證實了miR-423-3p在hESCs及其衍生EVs中均被有效敲減。隨后的免疫熒光顯示，與PbEE-NC組相比，PbEE-antagomir-miR-423-3p（PbEE-anta）組中EdU、pH3和ki67陽性的CMs顯著減少。這表明敲除miR-423-3p減弱了PbEE誘導的CM增殖。此外，抑制miR-423-3p顯著削弱了PbEE的抗凋亡作用，這反映在PbEE-anta組中TUNEL陽性CMs增加，cleaved-Caspase 3和Bax表達升高，而Bcl2水平降低。這些結果共同證明，miR-423-3p是PbEE促進CM增殖和抗凋亡的關鍵分子。

圖4 miR-423-3p通過靶向ZBTB7A/PKM2軸促進心肌細胞增殖。
（A）基于TargetScan和TarBase對miR-423-3p靶基因進行生物信息學預測。（B，C）心肌細胞經PbEE處理或未處理48 h后的糖酵解壓力測試曲線及細胞外酸化率（ECAR）定量分析（n=4）。（D）人和小鼠ZBTB7A mRNA 3′UTR中保守miR-423-3p結合位點的序列比對，以及野生型（WT）和突變型（Mut）熒光素酶報告載體構建示意圖。（E）HEK293T細胞共轉染miR-423-3p mimics與ZBTB7A-WT或ZBTB7A-Mut載體后的熒光素酶報告實驗（n=3）。（F，G）心肌細胞中ZBTB7A蛋白水平的Western blot分析及定量（n=4）。（H–K）EdU、Ki67和pH3陽性心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：增殖心肌細胞。比例尺：20 μm。（L，M）采用qRT-PCR和Western blot檢測PKM2在mRNA和蛋白水平的表達（n=6）。（N，O）調控miR-423-3p和ZBTB7A水平后，采用Seahorse分析心肌細胞糖酵解水平（n=3–4）。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.5 綠光通過TRP-Ca2+-CAMKII-CREB信號軸上調hESCs和EVs中的miR-423-3p

此前的研究表明，綠光PBM可以通過瞬時受體電位（TRP）通道誘導鈣內流，從而激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CAMKII）及其下游轉錄因子cAMP響應元件結合蛋白（CREB），進而調節靶基因的轉錄。為了探討綠光誘導hESCs及其EVs中miR-423-3p上調的上游機制，我們首先評估了其對細胞內鈣動員的影響。Fluo-4 AM熒光檢測表明，綠光照射顯著升高了hESCs內的鈣水平，而TRP通道抑制劑SKF消除了這種誘導作用。Western blot分析進一步揭示，綠光增強了CAMKII和CREB的磷酸化，這也因TRP通道抑制而受阻。接下來，我們通過qRT-PCR量化了miR-423-3p的表達。綠光暴露顯著提高了hESCs中pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p的水平，并相應增加了EVs中的成熟miR-423-3p。當TRP通道被抑制時，這些作用被逆轉，表明TRP-Ca2+通路對綠光誘導的miR-423-3p上調是必不可少的。

為了確定CREB是否直接調節miR-423-3p轉錄，我們對miR-423啟動子進行了熒光素酶報告基因檢測。CREB過表達顯著增強了熒光素酶活性，提示存在直接結合和轉錄激活。此外，hESCs中CREB敲減導致pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p顯著減少，證實了其調節作用?？偟膩碚f，這些發現表明，綠光激活TRP-Ca2+-CAMKII-CREB軸以促進hESCs中miR-423-3p轉錄，從而增加EVs中miR-423-3p的豐度。

圖5 miR-423-3p通過上調PKM2抑制心肌細胞凋亡。
（A，B）在有或無miR-423-3p過表達條件下，低氧24 h后心肌細胞TUNEL染色代表性圖像及凋亡心肌細胞定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。（C，D）miR-423-3p過表達后，低氧心肌細胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax蛋白水平的Western blot分析（n=4–5）。（E）心肌細胞共轉染agomir-miR-423-3p與ZBTB7A過表達載體或PKM2 siRNA后的JC-1熒光代表性圖像。紅色：聚合體；綠色：單體。比例尺：25 μm。（F）JC-1聚合體/單體熒光強度比值的定量分析（n=6）。（G，H）心肌細胞內活性氧（ROS，綠色）的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：25 μm。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.6 MiR-423-3p通過靶向ZBTB7A/PKM2軸調節心肌細胞周期激活、心肌細胞凋亡和血管生成

為了進一步研究miR-423-3p促進CM細胞周期激活的分子機制，我們使用TargetScan和TarBase算法進行生物信息學分析，以識別具有miR-423-3p保守結合位點的靶基因。在匹配兩個數據庫中的推斷靶標后，我們發現Zbtb7a、Rap2c、Pabpc1和Kctd2被兩種方法共同篩選出來。目前公認，促進代謝向糖酵解的轉化可以逆轉CM細胞周期停滯。在我們的研究中，通過海馬糖酵解壓力測試（Seahorse assay）評估，發現PbEE處理后CM糖酵解能力顯著增強。已有研究表明，ZBTB7A（POZ/BTB和POK轉錄因子家族成員）直接結合并抑制關鍵糖酵解基因（包括丙酮酸激酶M2，Pkm2）的轉錄，從而調節腫瘤進展。然而，ZBTB7A是否能介導CMs中的糖酵解代謝和MI后的心臟修復尚不清楚。因此，我們推測PbEE中的miR-423-3p可能通過下調ZBTB7A表達來促進CM糖酵解代謝，從而使CM能夠重新進入細胞周期。

為了證實這一假設，我們首先分別構建了攜帶ZBTB7A mRNA 3'UTR結合位點或突變位點的熒光素酶報告載體。當與miR-423-3p共轉染時，野生型ZBTB7A mRNA 3'UTR的熒光素酶活性被抑制，而當3'UTR結合序列突變時則沒有出現活性的降低，這表明miR-423-3p可以直接靶向ZBTB7A的3'UTR。然后，為了驗證miR-423-3p與ZBTB7A之間的關系，我們調節了CMs中miR-423-3p的表達，發現過表達miR-423-3p降低了ZBTB7A蛋白水平，而抑制miR-423-3p則增加了ZBTB7A蛋白的表達。這些結果證明miR-423-3p在CMs中直接靶向并負向調節ZBTB7A的表達。此外，我們檢驗了ZBTB7A是否能調節miR-423-3p在CM增殖中的調控作用。免疫熒光染色顯示，ZBTB7A的過表達抑制了由miR-423-3p誘導的EdU、Ki67和pH3陽性CM的增加。

隨后，我們進一步研究了miR-423-3p是否通過ZBTB7A影響PKM2表達，從而促進CMs中的糖酵解。結果顯示，過表達miR-423-3p顯著上調了PKM2的mRNA和蛋白質表達，但ZBTB7A的強制表達逆轉了miR-423-3p的促進作用。同時，我們進行了海馬糖酵解壓力測試來評估miR-423-3p和ZBTB7A在CM代謝中的作用。結果顯示，強制表達miR-423-3p增強了CMs的糖酵解能力，而同時過表達ZBTB7A則逆轉了miR-423-3p的糖酵解促進作用?？偟膩碚f，這些發現表明miR-423-3p抑制ZBTB7A表達，從而促進Pkm2轉錄，由此提升CMs中的糖酵解代謝并最終解除CM細胞周期的阻滯。

此外，我們發現，如TUNEL陽性CMs減少、cleaved-Caspase 3和Bax水平降低以及Bcl2表達上調所示，過表達CMs中的miR-423-3p顯著抑制了缺氧誘導的CM凋亡。眾所周知，PKM2不僅是需氧糖酵解的促進劑，也是線粒體穩態和細胞存活的調節劑。在本研究中，JC-1檢測顯示，由缺氧引起的CM線粒體膜電位下降由于miR-423-3p的過表達而得到顯著的保持。然而，miR-423-3p對線粒體膜電位的穩定作用卻被過表達ZBTB7A或敲低PKM2所抑制。此外，線粒體活性氧（ROS）的產生在ago-miR-423-3p組中顯著減少，而在CM中過表達ZBTB7A或敲低PKM2則能逆轉這一現象。此外，與CEE組相比，在PbEE處理的HUVECs中，我們也發現miR-423-3p和PKM2的表達顯著增加，同時ZBTB7A的水平有所降低?？偟膩碚f，這些結果表明miR-423-3p通過靶向PKM2維持CM線粒體功能、抑制細胞凋亡并促進血管生成。

為了進一步驗證miR-423-3p在MI后心臟修復中的作用，我們在小鼠MI模型中通過尾靜脈注射給予了agomir-miR-423-3p。接受agomir-miR-423-3p的小鼠表現出顯著改善的心臟功能和縮小的梗死面積。此外，agomir-miR-423-3p組的Ki67和pH3陽性CM數量明顯增加。agomir-miR-423-3p組的TUNEL陽性CM數量也相應減少。qRT-PCR分析證實，全身注射agomir導致心臟組織中miR-423-3p顯著過表達。另外，過表達miR-423-3p下調了ZBTB7A的表達，同時上調了心臟組織和成人CM中PKM2的表達。上述發現表明，過表達miR-423-3p可通過促進CM存活顯著改善MI后的心臟功能。

圖6 甲基丙烯酰化明膠（GelMA）微針（MN）貼片的制備與表征。
（A）GelMA微針制備流程示意圖。（B）完整微針貼片的宏觀數字圖像（左）及單個微針的放大圖（右）。比例尺：左圖1 mm，右圖200 μm。（C）不同放大倍數下顯示微針形貌的代表性掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。（D）壓縮測試中微針貼片的力學性能表征（應力-應變曲線）。比例尺：200 μm。（E，F）裝載Tracker探針標記PbEE（紅色）的微針貼片的光學和熒光顯微鏡圖像。（G）采用納米顆粒追蹤分析（NTA）定量檢測PbEE從微針貼片中隨時間釋放的累積釋放曲線（n=3）。（H）微針貼片與低氧心肌細胞共培養體系示意圖。使用BioRender.com繪制。（I，J）低氧3天并分別與單獨MN、游離PbEE或PbEE裝載微針（PbEE@MN）共孵育后，心肌細胞TUNEL染色代表性圖像及凋亡心肌細胞定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：50 μm。（K–M）處理7天后Ki67和pH3陽性心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性增殖信號。比例尺：20 μm。數據以均值±SEM表示。**P<0.01，***P<0.001。

3.7 ZBTB7A的過表達消除了PbEE在體內的心肌保護作用

為了進一步探究ZBTB7A在PbEE心肌保護作用中的角色，我們使用重組AAV9系統在接受PbEE治療的MI小鼠中誘導了心臟特異性的ZBTB7A過表達。不出所料，過表達ZBTB7A（MI+PbEE+AAV9-ZBTB7A）極大地抵消了PbEE對心臟收縮力的治療益處（如EF%和FS%相對于MI+PbEE+AAV9-NC組降低所證明的）。一致地，由PbEE誘導的梗死面積減小也被ZBTB7A的過表達所逆轉。此外，心臟組織的免疫熒光染色顯示，與MI+PbEE+AAV9-NC組相比，過表達ZBTB7A顯著減少了Ki67陽性CM的數量，增加了TUNEL陽性CM的比例，并降低了CD31的信號強度。Western blot分析顯示PbEE處理下調了ZBTB7A并上調了PKM2，而ZBTB7A的強制表達有效阻斷了PbEE誘導的PKM2上調。這些結果表明，ZBTB7A的過表達消除了PbEE的心肌保護作用。

圖7 PbEE@MN促進人胚胎干細胞來源心肌細胞（hESC-CMs）增殖并抑制其凋亡。
（A）hESC-CM分化流程示意圖。使用BioRender.com繪制。（B）PbEE@MN與hESC-CMs共培養實驗設計示意圖。（C，D）低氧3天后，經單獨MN、CEE、PbEE或PbEE@MN處理的hESC-CMs中TUNEL染色代表性圖像及凋亡細胞定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：20 μm。（E，F）共培養7天后Ki67?和pH3? hESC-CMs的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性增殖信號。比例尺：20 μm。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.8 負載PbEE的GelMA微針貼片的表征

盡管EVs具有治療前景，但其快速清除和靶部位的滯留性差阻礙了其臨床轉化。為了實現PbEE向梗死心肌的局部持續遞送，我們通過兩步模板法制備了甲基丙烯酰明膠（GelMA）微針（MN）貼片。光學顯微鏡顯示微針尖端呈圓錐形并排列成精確的陣列。該貼片由68根獨立的針組成，均勻分布在直徑為0.6 cm的圓形底板上。SEM顯示每根針尖平坦且完整，長度約為650 μm，基部直徑為320 μm。隨后我們評估了決定MN穿透心肌能力的機械性能，結果顯示單根針的機械強度為0.4 N，據報道這足以在不斷裂的情況下穿透心肌。為了可視化EV在水凝膠基質中的分布，我們將熒光標記的PbEE摻入MN貼片中。光學和熒光顯微鏡圖像都證實了EVs均勻分布在整個MN結構中。隨后進行了體外釋放研究以表征EVs的釋放動力學。在多個時間點通過NTA對釋放的EV顆粒的累積數量進行量化。釋放曲線顯示前三天內呈現初始突釋，隨后進入了較長時期的持續釋放階段。這些結果表明，MN貼片能夠在延長的時間段內持續遞送PbEE。

治療用MN應用中一個關鍵的考量是其制造過程是否會損害EV的完整性和生物活性。為了解決這個問題，我們比較了從溶解的MN中回收的PbEE（MN-PbEE）與天然未經處理的PbEE（NA-PbEE）。Zeta電位分析顯示MN-PbEE和NA-PbEE之間的表面電荷沒有顯著差異，這暗示其膜穩定性得以保持。TEM進一步證實MN-PbEE維持了其典型的杯狀形態。為了評估囊泡內裝載物的完整性，我們定量了PbEE中關鍵功能miRNA（miR-423-3p）的表達水平，結果未觀察到MN-PbEE和NA-PbEE之間存在顯著差異。然后我們在體外評估了MN-PbEE的細胞攝取和功能表現。攝取檢測顯示，MN-PbEE被CM內化的效率與NA-PbEE相當。在功能上，MN-PbEE能顯著增強CM增殖并抑制凋亡，其程度與NA-PbEE相似。此外，兩組EVs之間的促血管生成能力也沒有顯著差異。這些結果證明在MN制造后，PbEE的生物活性得到了保持。

接下來我們評估了與傳統的直接孵育相比，MN介導的遞送是否能進一步增強PbEE的治療效能。我們通過直接孵育或MN介導遞送用PbEE處理原代CMs 3-7天。后續分析顯示，與直接PbEE孵育相比，負載在MNs中的PbEE（PbEE@MN）對CM凋亡表現出更顯著的抑制作用。一致地，相對于直接的PbEE處理，PbEE@MN進一步增加了Ki67和pH3陽性CM的比例，表明對CM增殖的促進作用增強。為了進一步評估PbEE的臨床轉化潛力，我們將研究擴展至人類胚胎干細胞衍生的心肌細胞（hESC-CMs）。與原代NMCMs一致，PbEE在hESC-CMs中表現出比CEE更強的抗凋亡和細胞周期激活活性。重要的是，PbEE@MN的治療功效優于游離的PbEE。上述發現表明，封裝在MN內的PbEE表現出良好的穩定性，并對CM凋亡和細胞周期激活發揮持續的有益作用。

圖8 GelMA微針貼片延長PbEE滯留時間并增強其在MI中的治療效果。
（A）體內研究設計示意圖。使用BioRender.com繪制。（B）將PbEE裝載微針貼片應用于MI心臟的宏觀圖像。圖III和圖IV分別表示貼附后5 min和10 min的狀態。（C）植入后第3天微針貼片穩定附著于心臟表面。比例尺：1 mm。（D）H&E染色顯示微針穿透心肌組織的代表性圖像。比例尺：500 μm。（E）微針處理后第28天心臟宏觀圖像。比例尺：1 mm。（F）微針處理后第28天心臟Masson三色染色代表性圖像。比例尺：500 μm。（G）采用H&E染色檢測微針處理組心臟是否存在異常炎癥浸潤或結構改變。比例尺：50 μm。（H）采用qRT-PCR分析炎癥因子Tnfa、Il1b和Il6的mRNA表達（n=3）。（I）MI后第0、3和14天采用生物發光成像（BLI）追蹤心臟中EVs的分布（n=4）。（J）PbEE或PbEE@MN處理后第28天代表性M型超聲心動圖。（K）第28天梗死區域Masson三色染色代表性圖像。比例尺：500 μm。（L，M）左心室射血分數（LVEF）和短軸縮短率（LVFS）的定量分析（n=10）。（N）梗死面積定量分析（n=10）。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.9 PbEE@MN對MI小鼠的治療作用

基于體外研究證實MNs可以有效加載和釋放PbEE，我們進一步評估了PbEE@MN（負載了$3\times10^{10}$個PbEE顆粒）在成年小鼠MI模型中的治療潛力。將MN貼片放置在連接到真空的泵頭裝置上，通過將該裝置保持在梗死心臟上5秒，MN針尖完全插入心肌而沒有脫落。H&E染色顯示出MN針尖穿透心肌組織的針孔。為了評估MN貼片在體內的降解情況，我們在植入后第3、7和14天獲取了心臟表面貼片的圖像。圖像顯示結構完整性呈現時間依賴性降低，到第14天時貼片幾乎檢測不到。這一觀察通過Masson三色染色得到進一步驗證，證實了MN貼片具有可生物降解的性質。為了評估MNs的心臟安全性，將空MN穿透的心臟組織與正常心臟組織（Ctl）進行了比較。H&E染色顯示MN處理的心臟沒有異常的炎癥浸潤或結構改變。qRT-PCR進一步證實MN處理組和Ctl組之間炎癥因子Tnfa、Il1b和Il6的表達沒有顯著差異，表明MNs具有良好的生物相容性。為了測定PbEE在小鼠心肌中的保留率，我們利用Tracker探針標記的EVs來觀察心肌內注射PbEE和PbEE@MN處理后不同時間段心臟中的熒光信號。在第3天，PbEE@MN組的EV熒光強度顯著高于PbEE組。在第14天，注射PbEE的心臟中信號不再存在，但在使用PbEE@MN處理的心臟中信號仍然明顯。這些結果表明，制備的MN貼片能夠持續有效地將PbEE遞送至心肌缺血區域。

隨后，我們評估了PbEE@MN對梗死心臟的治療效果。結果表明，接受PbEE@MN治療（負載了$3\times10^{10}$個PbEE顆粒）的動物表現出比接受PbEE心肌內注射的動物在心臟功能、心/體重比、梗死面積和CM橫截面積方面更顯著的改善。免疫熒光染色和體視學分析表明，與注射PbEE的組相比，PbEE@MN組的Ki67、pH3和Aurora B陽性CM數量、單核CM比例以及CM總數顯著增加。此外，TUNEL分析顯示，PbEE@MN發揮的抗凋亡作用比直接注射PbEE更強（體現為凋亡CM的顯著減少）。同時，與注射PbEE組相比，PbEE@MN進一步促進了梗死心臟的血管生成。綜上所述，這些數據表明，MN貼片確實通過長時間持續釋放EVs提高了PbEE的治療效果。

為了進一步確認miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸在PbEE@MN介導的心肌保護中的關鍵作用，我們檢測了PbEE和PbEE@MN治療后MI心臟中ZBTB7A和PKM2的表達。結果顯示，PbEE@MN顯著抑制了心臟組織中ZBTB7A的表達并上調了PKM2的蛋白水平。然后，將敲低miR-423-3p的PbEE加載到MNs中（PbEE-anta@MN）并評估其對心臟修復的影響。我們發現沉默miR-423-3p部分消除了PbEE@MN對心肌損傷的保護作用。這些發現表明miR-423-3p是PbEE@MN介導心肌保護的關鍵分子。

圖9 通過微針貼片遞送PbEE促進心臟恢復并表現出良好生物相容性。
（A）MI后第28天心臟重量/體重比（n=6）。（B）麥胚凝集素（WGA）染色（綠色）代表性圖像及心肌細胞橫截面積定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（C）分離心肌細胞的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：100 μm。（D）MI后第14天心肌細胞核型模式的代表性圖像及定量分析，包括單核心、雙核心和多核心心肌細胞占總心肌細胞的比例（n=6）。比例尺：20 μm。（E）MI后第14天梗死邊緣區Ki67?、pH3?和Aurora B?心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性心肌細胞；方框區域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（F）MI后第7天梗死邊緣區凋亡心肌細胞的TUNEL染色（紅色）代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（G）MI后第28天梗死邊緣區CD31免疫熒光染色（綠色）及毛細血管密度定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（H，I）梗死邊緣區ZBTB7A和PKM2蛋白水平的Western blot分析（n=4）。（J）PbEE@MN處理后6、8和10周小鼠心臟H&E染色代表性圖像。比例尺：50 μm。（K）MI小鼠經PbEE@MN處理后，心臟中Desmin、Vimentin和Calb2的qRT-PCR分析（n=4）。（L）微針釋放后第14天收集殘留EVs，并采用納米顆粒追蹤分析（NTA）進行定量（n=4）。（M）處理后第28天主要器官（肝、脾、腎、腦、肺）的H&E染色代表性圖像（n=3）。比例尺：200 μm。數據以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.10 安全性評估

鑒于EVs中某些miRNAs可能存在致瘤風險，從而可能危及療效，我們進一步評估了基于PbEE療法的安全性情況。通過H&E染色進行的組織學檢查顯示，用PbEE@MN治療6、8和10周后，心臟組織均未出現形態學異常。與這些發現一致的是，對已確立的心臟腫瘤標志物（包括Desmin、Vimentin和Calb2）進行qRT-PCR分析顯示，與對照組相比并未見顯著上調，這表明在10周的治療期內不存在致瘤活性。此外，體外釋放研究表明，系統中的幾乎所有EVs在14天后均被釋放，表明長期滯留風險極低。此外，對肝臟、脾臟、腎臟、大腦和肺組織的H&E染色顯示沒有顯著的細胞死亡或炎癥浸潤，這也為多器官安全性提供了支持。綜合而言，這些結果表明，負載PbEE的GelMA微針貼片代表了一種增強MI后心臟再生和修復的安全有效策略。

【Citation】:Liu Y, Li S, Cai A, et al. Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism.Acta Pharmaceutica Sinica B.2026.

【貢獻】★★★★★

總之，本研究系統地表征了PbEE的心肌保護特性，這是一種在綠光照射下由hESCs衍生出的新型EVs。我們的研究結果表明，與天然EVs相比，PbEE對心肌缺血性損傷表現出更優越的保護功效。在機制上，PbEE向心肌細胞（CMs）遞送了豐富的miR-423-3p，隨后通過miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解通量，最終促進心肌細胞增殖并抑制細胞凋亡。此外，我們將PbEE封裝到基于GelMA的微針（MN）貼片中，建立了一個穩定的EV遞送系統。與直接心肌內注射相比，負載PbEE的微針貼片實現了EV的持續釋放，并對心肌梗死（MI）發揮了卓越的治療效果。

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