Nature |?泛素修飾不止于蛋白：非蛋白質泛素化的系統發現與檢測策略

撰文 | 阿童木

泛素化是細胞內最為經典的翻譯后修飾之一，長期以來被認為主要作用于蛋白質。通過其C端甘氨酸-甘氨酸（GG）基序，泛素通常與底物蛋白賴氨酸殘基形成穩定的異肽鍵，從而調控蛋白質的降解、定位及功能。這一修飾體系在蛋白酶體降解、信號轉導以及細胞穩態維持中發揮核心作用，構成了細胞質量控制與信息傳遞的重要基礎【1】。

然而，隨著對泛素化化學本質認識的加深，這一傳統 認知 開始出現松動。研究發現，泛素不僅可以連接至賴氨酸殘基，還能夠與半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸形成硫酯鍵或氧酯鍵【2】。更進一步的體外實驗表明，一些E3連接酶甚至可以催化泛素與非蛋白質分子發生共價連接，包括葡萄糖、聚糖以及多胺等代謝物 ，甚至可能涉及部分脂質【3】（ BioArt ： ） 。 因此 ， 泛素修飾的底物范圍可能遠超蛋白質本身，延伸至細胞代謝網絡之中 。

然而， 這一假設始終缺乏直接證據。現有蛋白質組學技術建立在肽段分析基礎上，難以檢測被泛素修飾的糖類、脂質或小分子代謝物。對于這些底物而言，泛素與其之間往往通過酯鍵連接，這類鍵在樣品處理過程中容易水解，使得修飾信號在進入質譜分析前即已丟失。因此， 非蛋白質泛素化在生物學上可能廣泛存在，卻在技術上長期處于“不可見”狀態 ，其在細胞中的真實存在、豐度以及潛在功能始終難以評估。

近日， 澳大利亞 沃爾特和伊麗莎·霍爾醫學研究所 David Komander 和 Marco Jochem 等在 Nature 雜志發表了題為 Ubiquitination of glycogen and metabolites i n cells and t issues 的研究論文， 該研究針對非蛋白質泛素化難以檢測的問題， 建立了基于Ub-clipping與 sortase 標記的質譜分析策略，將不穩定的酯鍵連接轉化為可富集、可 解析 的 質譜 信號 。利用該方法，作者 系統鑒定了糖類（如糖原）及多胺等非蛋白底物的泛素化修飾，并在細胞中驗證其存在及可調控性 。該工作拓展了泛素化底物譜，提示泛素修飾參與更廣泛的代謝調控過程。

本研究的核心在于作者 利用“Ub-clipping + sortase 標記 + LC-MS”，把原本不可檢測的非蛋白泛素化轉化為可捕獲、可富集、可測序的信號 。 具體而言， 作者首先利用特異性泛素剪切酶對泛素化底物進行處理，將泛素從底物上切除，同時在底物分子上保留一個GG殘基。這一殘基相當于一個穩定的“ 化學 標記位點”，可作為后續識別的分子特征。通過這一過程，原本 不穩定的泛素-底物連接被轉化為一種可被質譜識別的化學結構，為非蛋白質泛 素化的檢測提供了基礎。

在此基礎上，研究者進一步引入分選酶（ sortase ）標記步驟。分選酶能夠識別GG殘基，并將其轉化為帶有肽段特征的分子結構，使原本屬于糖類或小分子的底物獲得“ 類肽屬性 ”。這一轉化使其能夠進入蛋白質組學的標準分析流程，包括固相富集與高靈敏度納流液相色譜-質譜檢測。通過這一“ 從小分子到肽”的轉換 ，非蛋白質泛素化首次被納入成熟的質譜分析體系之中。

為驗證該方法的可行性，作者首先在體外體系中構建了多個模型底物。以E3連接酶HOIL-1L為代表， 作者 成功制備了泛素化的寡糖及糖原，并通過酶解與剪切處理，將其轉化為帶有GG標記的寡糖分子。這些產物在質譜中表現出明確的保留時間及特征性碎裂模式， 表明 該策略 能夠穩定識別非蛋白質底物上的泛素修飾 。更重要的是，原本難以分析的高分子糖原，在經過酶解后也可被轉化為可檢測的小分子片段，從而實現 對復雜底物的間接解析 。

在完成方法建立后，研究進一步轉向細胞體系驗證。作者通過構建基于FKBP/FRB的化學誘導鄰近系統，在Huh7細胞中實現HOIL-1L與糖原的定向共定位。誘導后，糖原富集區域出現明顯的泛素信號，并依賴于完整的泛素化系統。利用上述質譜策略， 作者 成功檢測到與體外實驗一致的GG標記寡糖分子。進一步的同位素 示蹤 顯示，這些信號來源于細胞內新合成的糖原，證明 非蛋白質泛素化不僅可以在體外重建，而且在細胞內真實發生 。

在此基礎上，作者開始探討這一修飾的潛在功能。研究發現，泛素化糖原可與溶酶體標志物LAMP1發生共定位，而不與內體標志物EEA1重疊。溶酶體抑制劑處理可顯著增強這一共定位現象，而抑制泛素化過程或破壞HOIL-1L催化活性則阻斷該過程。這些結果提示， 泛素化可能作為一種 分子標記 信號，介導糖原向溶酶體轉運 。進一步實驗表明， 泛素化并不導致糖原形成不溶性聚集體，而是維持其動態特性，并伴隨總體糖原水平的下降，提示其參與降解過程 。

這一發現將泛素化功能從蛋白質質量控制拓展至代謝物處理領域。進一步研究顯示，在糖原結構異常的模型中，這一機制被顯著放大。GBE1缺陷導致糖原結構紊亂并形成聚葡聚糖小體，同時伴隨泛素化水平顯著升高。對泛素系統的干預表明，LUBAC復合物及去泛素化酶OTULIN參與該過程的調控。這些結果將 泛素化機制與糖原代謝紊亂直接聯系起來 ，提示其可能在相關疾病中發揮作用。

作者進一步評估了非蛋白質泛素化的組織分布及動態變化。在小鼠多個組織中均檢測到泛素化糖原，其中肝臟和骨骼肌最為豐富。禁食實驗揭示了這一修飾的動態特征： 在糖原快速消耗階段，泛素化糖原相對比例顯著升高，提示其在代謝重編程過程中被優先調動 。值得注意的是，在特定條件下， 超過1%的細胞總泛素可連接于糖原 ，顯示其在泛素系統中的占比 不可 忽略 。

此外， 在大量質譜信號中篩選后，作者不僅檢測到了預期的糖類修飾，還鑒定出新的泛素化底物，包括甘油和精胺等小分子代謝物。代謝標記實驗表明，這些修飾與細胞代謝流密切相關，而對多胺合成的抑制則可顯著降低相應泛素化水平。這些結果進一步表明， 非蛋白質泛素化并非局限于糖類，而是廣泛存在于代謝網絡之中 。

綜上所述 ， 本 研究 通過方法學創新，將長期“不可見”的非蛋白質泛素化轉化為可系統分析的分子事件，并在細胞與動物水平上證明其真實存在及動態調控特性 。更重要的是，這一工作 從概念上拓展了泛素修飾的作用邊界，將其從蛋白質層面延伸至代謝層面， 提示泛素系統可能參與更廣泛的細胞物質流與代謝網絡調控過程 。這不僅為理解細胞代謝與蛋白質穩態之間的聯系提供了新的視角，也為未來探索代謝調控與疾病機制打開了新的方向。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10548-x

制版人： 十一

參考文獻

1. Lechtenberg, B. C. & Komander , D. Just how big is the ubiquitin system?Nat. Struct. Mol.Biol.1–4 (2024).

2. Pao, K.-C., et al . Activity-based E3 ligase profiling uncovers an E3 ligase with esterification activity.Nature556, 381–385 (2018).

3. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.Nature594, 111–116 (2021).

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