Metabolism I 鎖定脂肪肝進(jìn)展“放大器”：FAM83A驅(qū)動(dòng)MASH脂質(zhì)合成與炎癥纖維化惡化 (熊晶/郭樂(lè)/俞蘊(yùn)莉-中國(guó)藥科大學(xué))

2025年12月9日，中國(guó)藥科大學(xué)熊晶、寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院郭樂(lè)及蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院俞蘊(yùn)莉團(tuán)隊(duì)在代謝領(lǐng)域權(quán)威期刊Metabolism（中科院1區(qū)，IF=11.9）在線發(fā)表題為 “FAM83A acts as an amplifier for lipogenic signaling to facilitate the pathogenesis of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis” 的研究論文。

該研究聚焦代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）進(jìn)展過(guò)程中脂質(zhì)合成異常放大的關(guān)鍵機(jī)制，圍繞FAM83A如何響應(yīng)胰島素刺激，并通過(guò)結(jié)合RAF1激活ERK信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪酸和膽固醇生物合成，進(jìn)而推動(dòng)肝臟脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)和纖維化展開(kāi)系統(tǒng)研究。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A主要表達(dá)于肝細(xì)胞，并在MASH小鼠模型及臨床患者肝組織中顯著上調(diào)；肝細(xì)胞特異性敲除FAM83A可減輕肝脂肪變性、炎癥和纖維化，而其過(guò)表達(dá)則顯著加重MASH病理進(jìn)程。該研究揭示了FAM83A作為脂質(zhì)生成信號(hào)“放大器”驅(qū)動(dòng)MASH發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為靶向FAM83A-RAF1/ERK軸干預(yù)MASH及代謝性血脂異常提供了新的潛在治療策略。

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代謝與整合生物學(xué)微信公眾號(hào)_20260509.pdf

【摘要】

背景與目的：代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）及其更嚴(yán)重的表現(xiàn)形式——代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH），與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。盡管表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）下游信號(hào)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶RAF1，在MASH進(jìn)展過(guò)程中呈現(xiàn)增強(qiáng)激活狀態(tài)，但其在驅(qū)動(dòng)MASH發(fā)生發(fā)展中的具體作用及潛在機(jī)制仍未得到充分闡明。

方法：本研究開(kāi)展了綜合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以鑒定參與MAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲低或過(guò)表達(dá)FAM83A的小鼠模型，并分別給予高脂飲食（HFD）8周或14周，以模擬單純性脂肪變性（MAFL）和MASH；同時(shí)采用膽堿缺乏高脂飲食（CDAHFD）加速M(fèi)ASH進(jìn)展。

結(jié)果：FAM83A被認(rèn)為是EGFR下游可激活ERK信號(hào)通路的效應(yīng)分子，主要表達(dá)于肝細(xì)胞，并在動(dòng)物模型和臨床患者的MASH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中上調(diào)。肝細(xì)胞特異性敲除FAM83A可延緩MASH進(jìn)展，并減輕肝臟炎癥和纖維化。相反，F(xiàn)AM83A過(guò)表達(dá)會(huì)加重MASH病理改變，表現(xiàn)為脂質(zhì)堆積、炎癥和纖維化增加。機(jī)制上，胰島素可誘導(dǎo)FAM83A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而FAM83A可與RAF1發(fā)生物理結(jié)合，增強(qiáng)RAF1磷酸化及后續(xù)ERK信號(hào)激活。此外，RAF1抑制劑索拉非尼或ERK抑制劑PD98059處理可顯著抑制FAM83A介導(dǎo)的脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)及脂質(zhì)生成。

結(jié)論：FAM83A通過(guò)與RAF1相互作用激活ERK信號(hào)，從而促進(jìn)脂肪酸和膽固醇生物合成，并推動(dòng)MASH發(fā)生發(fā)展。靶向該信號(hào)軸可能為MASH及代謝性血脂異常提供潛在治療策略。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）曾被稱為非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），是全球最常見(jiàn)的慢性肝病，并預(yù)計(jì)到2030年將成為肝移植的首要適應(yīng)證。MAFLD疾病譜從單純性脂肪肝（MAFL）發(fā)展至代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH），后者以肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化為主要特征。目前已有的MASH治療選擇仍存在明顯不良反應(yīng)。因此，闡明MAFLD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于識(shí)別新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

MAFL/MASH的一個(gè)重要特征是從頭脂質(zhì)生成（DNL）上調(diào)，其標(biāo)志是限速酶乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FASN）的表達(dá)升高。ACC可將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，而FASN則將丙二酰輔酶A延長(zhǎng)形成脂肪酸鏈。DNL激活與肝臟葡萄糖攝取增加及胰島素抵抗發(fā)生密切相關(guān)，并進(jìn)一步加劇MAFL/MASH進(jìn)展。過(guò)度DNL還會(huì)在胰島素抵抗與脂毒性之間形成惡性循環(huán)，驅(qū)動(dòng)肝臟炎癥、肝星狀細(xì)胞活化和纖維化，從而加速M(fèi)AFLD/MASH進(jìn)展。藥理性抑制DNL可在MASH模型中減輕脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變和纖維化。盡管ACC抑制劑和FASN抑制劑在臨床試驗(yàn)中顯示出降低肝臟脂肪變性和纖維化的潛力，但目前尚無(wú)相關(guān)藥物獲批用于MASH治療，這凸顯了進(jìn)一步深入解析DNL調(diào)控機(jī)制的必要性。

多條信號(hào)通路參與MASH發(fā)生發(fā)展，包括調(diào)控脂質(zhì)/葡萄糖穩(wěn)態(tài)的GLP1、mTOR和PPAR通路，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的STAT和TGF-β通路，以及參與炎癥反應(yīng)的TRAF6-ASK1和NF-κB通路。PI3K-AKT-mTOR和MAPK級(jí)聯(lián)通路位于EGFR激活的下游，并可通過(guò)刺激關(guān)鍵脂質(zhì)合成酶表達(dá)促進(jìn)MASH發(fā)生過(guò)程中的肝臟脂質(zhì)生成。其中，MAPK通路RAF1/ERK分支在MASH中的作用仍 largely 尚未被深入探索。

FAM83A是序列相似性83（FAM83）家族成員，是一種新興的致癌靶點(diǎn)，參與多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，近期也被發(fā)現(xiàn)與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)。EGFR激活的FAM83A與RAF1和PI3K相關(guān)，可驅(qū)動(dòng)下游MEK/ERK通路激活，這被認(rèn)為是FAM83A介導(dǎo)癌變及EGFR抑制劑耐藥的重要機(jī)制之一。FAM83A還可結(jié)合酪蛋白激酶1（CK1），調(diào)控線粒體外膜通透性。本研究通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)FAM83A在MAFL/MASH進(jìn)展過(guò)程中持續(xù)上調(diào)。進(jìn)一步利用肝臟特異性FAM83A敲除和過(guò)表達(dá)小鼠模型，本研究探討其在MAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用，并提出FAM83A可能通過(guò)增強(qiáng)EGFR驅(qū)動(dòng)的信號(hào)通路加重該疾病。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

3.1 Fam83a是MAFL和MASH肝臟中上調(diào)的基因

首先，本研究采用穩(wěn)健秩聚合（RRA）分析整合并排序來(lái)自6個(gè)小鼠MAFLD GEO數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因，分別獲得了MAFLD肝臟中上調(diào)和下調(diào)基因的排序列表，并展示了排名前15位的基因（圖1A）。作為MAFLD發(fā)病過(guò)程中預(yù)測(cè)的重要因素，本研究通過(guò)DESeq2對(duì)上述6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并提取Fam83a的RNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在MAFL或MASH小鼠肝臟中，F(xiàn)am83a表達(dá)顯著上調(diào)（圖1B–G）。此外，研究將MAFL和MASH轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM并進(jìn)行合并，隨后鑒定差異表達(dá)基因并開(kāi)展KEGG功能富集分析（圖1H）。結(jié)果顯示，F(xiàn)am83a在MAFL肝臟中顯著升高，并在MASH肝臟中進(jìn)一步放大（圖1I）。Fam83a表達(dá)變化與MASH發(fā)生過(guò)程中炎癥、纖維化和代謝相關(guān)經(jīng)典基因的變化趨勢(shì)相一致（圖1H）。同時(shí)，對(duì)ob/ob糖尿病小鼠肝臟的差異基因分析也顯示Fam83a顯著上調(diào)（圖1J）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AM83A與MAFLD的起始和進(jìn)展密切相關(guān)。

隨后，為驗(yàn)證FAM83A在HFD誘導(dǎo)MAFLD小鼠肝臟中的表達(dá)升高，研究給予野生型小鼠連續(xù)12周高脂飲食。肝臟H&E染色顯示，HFD組肝細(xì)胞核大小不一，脂肪空泡增加，并出現(xiàn)小葉炎癥，表現(xiàn)為NAFLD活動(dòng)性評(píng)分（NAS）升高（圖1K左，圖1L）。油紅O染色顯示，與對(duì)照組相比，HFD組脂肪堆積更加明顯（圖1K右，圖1M）。qRT-PCR和Western blot分析顯示，HFD誘導(dǎo)的MAFLD小鼠肝臟中FAM83A的mRNA和蛋白表達(dá)均升高（圖1R）。這些結(jié)果表明，在MAFLD建立過(guò)程中，隨著肝臟脂肪堆積增加，F(xiàn)AM83A表達(dá)也顯著升高。

為進(jìn)一步確認(rèn)FAM83A在MASH這一MAFLD更嚴(yán)重階段中的表達(dá)升高，研究給予野生型小鼠連續(xù)10周CDAHFD飲食。與對(duì)照組相比，CDAHFD喂養(yǎng)小鼠的肝組織H&E染色和油紅O染色顯示脂肪堆積和NAS評(píng)分增加（圖1N左及中，圖1O–P）。同時(shí)，天狼星紅染色顯示模型組出現(xiàn)明顯纖維化（圖1N右，圖1Q）。qRT-PCR和Western blot分析顯示，CDAHFD誘導(dǎo)的MASH小鼠肝臟中FAM83A表達(dá)同樣升高（圖1R）。

進(jìn)一步研究FAM83A在不同肝臟細(xì)胞類型中的表達(dá)情況。研究利用AMLN飲食誘導(dǎo)MASH模型的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集分析MASH發(fā)生過(guò)程中Fam83a的細(xì)胞來(lái)源。結(jié)果顯示，與普通飲食相比，F(xiàn)am83a在MASH肝臟中明顯升高，尤其富集于肝細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞簇（圖1S）。隨后，研究分離小鼠原代肝細(xì)胞（MPH）和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPC），并檢測(cè)FAM83A表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)HSC標(biāo)志物DESMIN和肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF4α（圖1U）。結(jié)果顯示，HNF4α富集于MPH部分，DESMIN富集于NPC部分；與NPC相比，F(xiàn)AM83A在MPH中表達(dá)更高，并在MASH發(fā)生過(guò)程中進(jìn)一步增強(qiáng)（圖1T–U）。為建立臨床相關(guān)性，研究分析了包含健康和不同階段MASH活檢樣本的臨床患者數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)FAM83A主要表達(dá)于肝細(xì)胞（圖1V）。通過(guò)收集和分析臨床患者肝穿刺活檢樣本，研究進(jìn)一步證實(shí)，與健康對(duì)照相比，MASH患者肝臟FAM83A表達(dá)上調(diào)（圖1W）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)AM83A主要表達(dá)于肝細(xì)胞，并在人體患者和小鼠模型的MASH發(fā)生過(guò)程中顯著上調(diào)。

圖1 飲食誘導(dǎo)MAFLD小鼠模型和ob/ob模型中肝臟FAM83A表達(dá)升高。
（A）采用穩(wěn)健秩聚合分析小鼠MASH模型中差異表達(dá)基因的熱圖。紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)。（B–G）GEO數(shù)據(jù)集中MAFLD模型肝臟Fam83a基因表達(dá)。（H）利用GSE199121（MAFL）和GSE189066（MASH）數(shù)據(jù)集，通過(guò)DESeq2鑒定差異表達(dá)基因，并采用KEGG進(jìn)行功能富集分析。（I）GSE199121（MAFL）和GSE189066（MASH）數(shù)據(jù)集中Fam83a基因變化的TPM分析。（J）小鼠ob/ob模型中差異mRNA表達(dá)火山圖。（K–M）小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周。肝組織H&E染色（比例尺：100 μm）和油紅O染色（比例尺：100 μm）（K）、NAS評(píng)分（L）及脂滴面積定量分析（M）。（N–Q）小鼠CDAHFD喂養(yǎng)10周。肝組織H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）和天狼星紅染色（比例尺：20 μm）（N）、脂滴面積定量分析（O）、NAS評(píng)分（P）及天狼星紅陽(yáng)性面積（Q）。（R）HFD和CDAHFD模型中肝臟FAM83A蛋白和mRNA表達(dá)。HFD（n=7），CDAHFD（Ctrl：n=7；CDAHFD：n=9）。（S）基于AMLN飲食誘導(dǎo)MASH小鼠模型單細(xì)胞RNA測(cè)序分析的Fam83a細(xì)胞類型富集情況。（T–U）HFD喂養(yǎng)8周后，小鼠原代肝細(xì)胞（MPH）和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPC）中Fam83a mRNA（T）和蛋白（U）表達(dá)。（V）基于涵蓋健康及4個(gè)階段MASH活檢樣本的臨床患者單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，展示FAM83A的細(xì)胞類型表達(dá)譜。（W）與健康對(duì)照相比，人MASH患者肝臟FAM83A蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。p>0.05表示無(wú)顯著差異，*p<0.05，**p<0.01；采用雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。

3.2 肝臟特異性敲除FAM83A減輕MASH進(jìn)

為研究FAM83A對(duì)MASH發(fā)病過(guò)程的影響，本研究通過(guò)向Cas9fl/fl敲入小鼠尾靜脈注射表達(dá)靶向Fam83a特異性sgRNA的重組AAV8，構(gòu)建肝細(xì)胞特異性FAM83A敲除（LKO）小鼠，并給予HFD喂養(yǎng)不同時(shí)間，以分別模擬MAFLD早期或晚期階段（圖2A）。Western blot結(jié)果顯示，肝臟特異性敲除小鼠中FAM83A表達(dá)低于對(duì)照小鼠，驗(yàn)證了敲除效率（圖2B）。LKO小鼠血糖降低（圖2C），腹股溝白色脂肪組織/體重比下降，而肝重/體重比未見(jiàn)顯著差異（圖2D）。與對(duì)照組相比，F(xiàn)AM83A缺失8周后，小鼠肝組織H&E和油紅O染色顯示NAS評(píng)分及脂肪空泡顯著減少（圖2E–G）。LKO小鼠血清和肝臟TG/TC水平降低（圖2H–J），與極低密度脂蛋白（VLDL）組裝相關(guān)基因Mttp和Apo100b下調(diào)一致（圖2K）。腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)也提示，肝臟FAM83A缺失小鼠葡萄糖利用增強(qiáng)（圖2L），與血糖水平降低相一致（圖2D）。此外，血清ALT和AST水平降低提示肝損傷減輕（圖2M）。在MAFLD過(guò)程中，F(xiàn)AM83A缺失特異性降低脂肪酸合成基因（Fasn）、膽固醇合成基因（Hmgcr、Ldlr和Srebp2）以及HSC活化相關(guān)基因（Timp1、Mmp13和Acta2）的mRNA表達(dá)（圖2N–O）。這些結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)AM83A缺失可改善MAFL。

當(dāng)HFD喂養(yǎng)延長(zhǎng)至14周時(shí)，LKO小鼠同樣表現(xiàn)出脂肪堆積減少、NAS評(píng)分降低、纖維化減輕以及血清ALT/AST下降（圖2P–S），并伴隨肝臟Acta2、Mmp13、Timp1和Col1a1表達(dá)受到抑制（圖2T）。Western blot分析顯示，在MASH發(fā)生過(guò)程中，F(xiàn)AM83A缺失抑制了膽固醇合成相關(guān)蛋白（SREBP1激活、HMGCR和LDLR）以及脂肪酸合成相關(guān)蛋白FASN的表達(dá)（圖2U）。這些數(shù)據(jù)表明，肝臟特異性敲除FAM83A可通過(guò)抑制脂肪酸和膽固醇合成，減輕肝臟脂肪變性和纖維化。

進(jìn)一步地，研究給予FAM83A LKO小鼠CDAHFD喂養(yǎng)7周，以模擬MASH發(fā)生過(guò)程（圖3A）。Western blot結(jié)果確認(rèn)小鼠肝臟中FAM83A被有效破壞（圖3B–C）。結(jié)果顯示，肝重/體重比未見(jiàn)明顯差異，腹股溝白色脂肪組織/體重比和血糖略有升高（圖3D–F）。LKO小鼠血清及肝臟TG/TC降低，同時(shí)血清ALT和AST下降，提示肝損傷減輕（圖3G–I）。與對(duì)照組相比，F(xiàn)AM83A缺失小鼠肝組織H&E、油紅O和天狼星紅染色顯示脂肪堆積、NAS評(píng)分和纖維化顯著降低（圖3J–K）。為進(jìn)一步闡明肝臟特異性敲除FAM83A對(duì)CDAHFD誘導(dǎo)MASH模型肝纖維化的影響，研究對(duì)活化HSC分泌的蛋白聚糖decorin（DCN）進(jìn)行了免疫熒光染色（圖3L）。DCN積累減少與HSC活化相關(guān)基因Timp1、Mmp13和Col1a1下調(diào)一致。此外，肝細(xì)胞FAM83A缺失還特異性降低脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Fabp4和Fatp1表達(dá)（圖3O）。這些結(jié)果提示，肝臟特異性FAM83A缺失可減輕CDAHFD誘導(dǎo)MASH模型中的肝纖維化。

圖2 肝臟特異性敲除FAM83A減輕HFD誘導(dǎo)的MASH發(fā)生。
（A）HFD喂養(yǎng)小鼠模型示意圖。（B）Western blot分析肝臟FAM83A蛋白表達(dá)（以β-ACTIN歸一化）（n=3）。（C）HFD喂養(yǎng)8周小鼠血糖（Ctrl：n=6；LKO：n=8）。（D）HFD喂養(yǎng)8周小鼠腹股溝白色脂肪組織/體重比（左）和肝重/體重比（右）（Ctrl：n=6；LKO：n=8）。（E）HFD喂養(yǎng)8周小鼠腹股溝白色脂肪組織H&E染色（比例尺：200 μm）、肝組織H&E染色（比例尺：20 μm）及肝組織油紅O染色（比例尺：20 μm）。（F）HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝組織脂滴面積定量分析（n=4）。（G）HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝組織NAS評(píng)分（n=3）。（H）HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝臟TC和TG水平（Ctrl：n=6；LKO：n=8）。（I–J）HFD喂養(yǎng)8周小鼠血清TC和TG水平（Ctrl：n=6；LKO：n=8）。（K）qRT-PCR分析HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝臟Mttp和Apo100b mRNA表達(dá)（n=6）。（L）HFD喂養(yǎng)12周時(shí)葡萄糖耐量試驗(yàn)（n=6）。（M）HFD喂養(yǎng)8周小鼠血清ALT和AST水平（Ctrl：n=6；LKO：n=8）。（N）qRT-PCR分析HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)（n=5）。（O）qRT-PCR分析HFD喂養(yǎng)8周小鼠肝臟纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)（n=6）。（P）HFD喂養(yǎng)14周小鼠肝組織H&E染色（比例尺：50 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（Q）HFD喂養(yǎng)14周小鼠肝組織NAS評(píng)分（n=3）。（R）HFD喂養(yǎng)14周小鼠天狼星紅陽(yáng)性面積（n=4）。（S）HFD喂養(yǎng)14周小鼠血清ALT和AST水平（n=6）。（T）qRT-PCR分析HFD喂養(yǎng)14周小鼠肝臟纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)（n=5）。（U）HFD喂養(yǎng)14周小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)（n=4）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。p>0.05表示無(wú)顯著差異，*p<0.05，**p<0.01；采用單因素方差分析并進(jìn)行Bonferroni多重比較。

圖3 肝臟特異性敲除FAM83A改善CDAHFD誘導(dǎo)MASH模型中的肝脂肪變性和纖維化。
（A）CDAHFD喂養(yǎng)小鼠模型示意圖。（B–C）Western blot分析肝臟FAM83A蛋白表達(dá)（n=3）。（D–I）血糖（D）、肝重/體重比（E）、腹股溝白色脂肪組織/體重比（F）、血清ALT/AST（G）、血清TC/TG（H）及肝臟TC/TG（I）（n=7）。（J）肝組織H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）和天狼星紅染色（比例尺：200 μm）。（K）NAS評(píng)分、天狼星紅陽(yáng)性面積和脂滴面積定量分析（n=3）。（L–M）肝組織切片DCN免疫熒光染色（L）及定量分析（M）（比例尺：100 μm；n=3）。（N–O）qRT-PCR分析肝臟纖維化相關(guān)基因（N）和代謝相關(guān)基因（O）mRNA表達(dá)（n=7）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。p>0.05表示無(wú)顯著差異，*p<0.05，**p<0.01；采用單因素方差分析并進(jìn)行Bonferroni多重比較。

3.3 肝臟特異性過(guò)表達(dá)FAM83A加重MASH進(jìn)展

為進(jìn)一步確認(rèn)FAM83A對(duì)MASH發(fā)病過(guò)程的影響，研究向野生型小鼠注射AAV以誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)FAM83A，隨后給予HFD喂養(yǎng)15周（圖4A）。與對(duì)照小鼠相比，肝臟特異性過(guò)表達(dá)小鼠肝臟中FAM83A表達(dá)更高，驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)效率（圖4B–C）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)AM83A肝臟特異性過(guò)表達(dá)小鼠體重及腹股溝白色脂肪組織/體重比增加，而肝重/體重比和血糖未發(fā)生顯著變化（圖4D–F）。血清和肝臟TC/TG以及血清ALT/AST水平均升高（圖4G–I），同時(shí)NAS評(píng)分、脂滴面積和纖維化面積增加（圖4J–M）。此外，F(xiàn)AM83A還增加了浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)更明顯的HSC活化，表現(xiàn)為F4/80和DCN免疫染色增強(qiáng)（圖4N–O）。FAM83A過(guò)表達(dá)還上調(diào)肝臟纖維化相關(guān)基因Timp1和Mmp13，以及脂肪酸合成基因Acly（圖4P–Q）。這些數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)AM83A通過(guò)加重肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，惡化HFD誘導(dǎo)的MAFLD。

隨后，研究給予肝細(xì)胞特異性FAM83A過(guò)表達(dá)小鼠CDAHFD喂養(yǎng)7周（圖5A）。結(jié)果證實(shí)，小鼠肝臟中FAM83A表達(dá)上調(diào)（圖5B–C）。盡管FAM83A未影響肝重、脂肪組織重量和血糖（圖5D–F），但FAM83A過(guò)表達(dá)小鼠血清ALT/AST、TC/TG以及肝臟TG均升高（圖5G–I）。纖維化相關(guān)基因Timp1和Acta2表達(dá)上調(diào)，與巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80和HSC標(biāo)志物DCN免疫染色增強(qiáng)相一致，說(shuō)明FAM83A促進(jìn)肝纖維化和炎癥（圖5J–K）。此外，F(xiàn)AM83A功能獲得組中脂肪空泡、脂滴以及纖維化均顯著增加（圖5L）。這些數(shù)據(jù)提示，肝臟特異性過(guò)表達(dá)FAM83A可在MASH進(jìn)展過(guò)程中加重肝纖維化和炎癥。

圖4 肝臟特異性過(guò)表達(dá)FAM83A加重HFD誘導(dǎo)的MASH發(fā)生。
（A）HFD喂養(yǎng)15周小鼠模型示意圖。（B）Western blot分析肝臟FAM83A蛋白表達(dá)（n=4）。（C）肝組織中Fam83a相對(duì)mRNA表達(dá)（Ctrl：n=5；FAM83A：n=6）。（D–I）體重（D）、血糖（E）、肝重/體重比和脂肪組織/體重比（F）、血清TC/TG（G）、肝臟TC/TG（H）及血清ALT/AST（I）（Ctrl：n=5；FAM83A：n=6）。（J–L）肝組織H&E染色（J）、天狼星紅染色（K）和油紅O染色（L）（比例尺：100 μm）。（M）NAS評(píng)分（n=3）、天狼星紅陽(yáng)性面積（n=6）及脂滴面積（n=7）定量分析。（N–O）肝組織切片中F4/80和DCN免疫熒光染色及定量分析（比例尺：50 μm；n=3）。（P–Q）肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因（P）和纖維化相關(guān)基因（Q）相對(duì)mRNA表達(dá)（Ctrl：n=5；FAM83A：n=6）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。p>0.05表示無(wú)顯著差異，*p<0.05，**p<0.01；采用雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。

圖5 肝臟特異性過(guò)表達(dá)FAM83A惡化CDAHFD誘導(dǎo)的MASH進(jìn)展。
（A）CDAHFD喂養(yǎng)7周小鼠模型示意圖。（B–C）Western blot和qRT-PCR分析肝臟FAM83A蛋白（B；n=6）和mRNA（C；n=8）表達(dá)。（D–F）血糖（D）、肝重/體重比（E）和脂肪組織/體重比（F）（n=8）。（G）血清ALT/AST水平（n=8）。（H–I）血清TC/TG水平（H）和肝臟TC/TG含量（I）（n=8）。（J）qRT-PCR分析肝臟纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)（n=7）。（K）肝組織切片中DCN（左）和F4/80（右）免疫熒光染色及定量分析（比例尺：50 μm；n=3）。（L）肝組織切片油紅O染色（比例尺：100 μm）和天狼星紅染色（比例尺：200 μm）及定量分析（n=4）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。p>0.05表示無(wú)顯著差異，*p<0.05，**p<0.01；采用雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。

3.4 FAM83A響應(yīng)胰島素處理并在體外刺激肝細(xì)胞脂質(zhì)生成

常見(jiàn)代謝病知識(shí)門戶（CMDKP）可用于探索遺傳數(shù)據(jù)與疾病過(guò)程之間的關(guān)系。因此，本研究利用該平臺(tái)分析FAM83A表達(dá)與常見(jiàn)代謝疾病之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A主要與糖脂代謝相關(guān)，包括TG水平、胰島素抵抗和2型糖尿病，提示FAM83A與代謝紊亂之間存在聯(lián)系（圖6A）。因此，研究采用不同濃度胰島素（100、200或400 nM）處理AML12細(xì)胞。結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)AM83A蛋白表達(dá)隨胰島素處理呈濃度依賴性顯著升高（圖6B）。

為進(jìn)一步探究胰島素誘導(dǎo)FAM83A上調(diào)的調(diào)控機(jī)制，研究檢測(cè)胰島素信號(hào)是否調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。胰島素刺激后，F(xiàn)am83a mRNA水平顯著升高，而RNA聚合酶II抑制劑放線菌素D處理可顯著削弱這一升高（圖6C）。一致地，放線菌素D或蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺均可減弱胰島素誘導(dǎo)的FAM83A蛋白上調(diào)（圖6D）。這些結(jié)果表明，胰島素通過(guò)依賴基因轉(zhuǎn)錄且需要新生蛋白合成的機(jī)制促進(jìn)FAM83A表達(dá)。隨后，研究在AML12細(xì)胞中開(kāi)展FAM83A功能獲得或功能缺失實(shí)驗(yàn)（圖6E）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證FAM83A對(duì)脂質(zhì)合成的影響，研究檢測(cè)了參與脂肪酸和膽固醇合成的相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，敲低FAM83A可降低膽固醇合成相關(guān)蛋白LDLR、HMGCR以及脂肪酸合成相關(guān)蛋白FASN、ACC1表達(dá)（圖6F），而FAM83A過(guò)表達(dá)則使這些蛋白表達(dá)升高（圖6G）。此外，對(duì)FAM83A過(guò)表達(dá)或敲低的AML12細(xì)胞給予300 μM油酸處理，并采用油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，F(xiàn)AM83A可增加脂滴數(shù)量和大?。▓D6H–J）。作為已知的脂質(zhì)生成刺激因子，EGF（50 ng/mL）處理AML12細(xì)胞后，采用Bodipy染色檢測(cè)脂滴。結(jié)果顯示，EGF可刺激脂滴形成，而這一作用在FAM83A敲低細(xì)胞中被顯著減弱（圖6K）。這些數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)AM83A可響應(yīng)胰島素信號(hào)，并進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)生物合成。

圖6 FAM83A通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)合成基因表達(dá)刺激肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積。
（A）CMDKP網(wǎng)站中FAM83A常見(jiàn)變異與相關(guān)表型的橫向基因關(guān)聯(lián)分析。TG：甘油三酯；LFR：腿部脂肪比例；Incr30：口服葡萄糖耐量試驗(yàn)30 min胰島素增量；AUCins：胰島素曲線下面積；TFR：軀干脂肪比例；nonHDL：非高密度脂蛋白膽固醇；Ins30adjBMI：經(jīng)BMI校正的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)30 min胰島素；SevereDKD：重度糖尿病腎??；UACR_DM：糖尿病受試者尿白蛋白/肌酐比值；CIR：校正胰島素反應(yīng)；ISen：胰島素敏感性；lateDKD_T2D：2型糖尿病晚期糖尿病腎?。籌SI：Matsuda胰島素敏感性指數(shù)。（B）分別采用不同濃度胰島素（0、100、200、400 nM）處理AML12細(xì)胞，并分析FAM83A表達(dá)。（C）胰島素（400 nM）和放線菌素D（ActD；5 μg/mL）處理后Fam83a相對(duì)mRNA表達(dá)。（D）在環(huán)己酰亞胺（CHX，30 μg/mL）或ActD（5 μg/mL）存在條件下，胰島素（400 nM）處理AML12細(xì)胞后FAM83A蛋白的Western blot分析。（E）通過(guò)蛋白表達(dá)水平確認(rèn)FAM83A在AML12細(xì)胞中成功敲低或過(guò)表達(dá)。（F–G）FAM83A敲低或過(guò)表達(dá)后，AML12細(xì)胞中膽固醇合成相關(guān)蛋白（LDLR、HMGCR）和脂肪酸合成相關(guān)蛋白（FASN、ACC1）的表達(dá)。（H）FAM83a過(guò)表達(dá)（左）或敲低（右）的AML12細(xì)胞經(jīng)300 μM油酸（OA）處理后進(jìn)行油紅O染色（比例尺：100 μm）。（I–J）FAM83A過(guò)表達(dá)細(xì)胞（I）（n=3）和FAM83A敲低細(xì)胞（J）（n=4）中脂滴面積定量分析。（K）FAM83A敲低的AML12細(xì)胞經(jīng)EGF（50 ng/mL）處理后進(jìn)行Bodipy染色（比例尺：50 μm）。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

3.5 FAM83A與RAF1發(fā)生物理相互作用并激活ERK信號(hào)，從而增強(qiáng)脂質(zhì)生成

FAM83A作為一種潛在腫瘤治療靶點(diǎn)，可調(diào)控包括EGFR和MAPK在內(nèi)的多條信號(hào)通路，并在多種惡性腫瘤的發(fā)生和耐藥中上調(diào)并發(fā)揮重要作用。因此，本研究采用EGF（50 ng/mL）處理AML12細(xì)胞，并在FAM83A過(guò)表達(dá)或敲低條件下檢測(cè)磷酸化MAPK底物。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A過(guò)表達(dá)增加了關(guān)鍵MAPK信號(hào)組分的磷酸化水平（圖7A），而FAM83A敲低則顯著降低EGF處理誘導(dǎo)的這些磷酸化蛋白水平（圖7B）。

鑒于已有研究顯示，在EGF處理?xiàng)l件下，內(nèi)源性FAM83A可與RAF1和PI3K p85亞基相互作用，并激活下游MEK/ERK通路，因此本研究在檢測(cè)MAPK信號(hào)組分（P-ERK、P-P38、P-JNK）的同時(shí)，也評(píng)估了Akt信號(hào)通路激活及RAF1磷酸化水平。值得注意的是，F(xiàn)AM83A特異性升高P-ERK/ERK和P-RAF1/RAF1信號(hào)（圖7C–D）。與此一致，體內(nèi)FAM83A過(guò)表達(dá)或缺失分別特異性激活或減弱P-ERK和P-RAF1水平，而對(duì)P-AKT及其他MAPK下游效應(yīng)分子（P-JNK或P-P38）未產(chǎn)生顯著且一致的影響（圖7E–F）。這些發(fā)現(xiàn)促使研究進(jìn)一步聚焦于闡明FAM83A調(diào)控RAF1/ERK信號(hào)通路的機(jī)制。

隨后，考慮到RAF1在P-ERK信號(hào)激活中的作用，研究探索了FAM83A與RAF1之間的物理相互作用。分子對(duì)接證實(shí)FAM83A可與RAF1結(jié)合，提示FAM83A中的K216、N217、E280、D283和R287，以及RAF1中的Q520、N553和R563參與結(jié)合界面（圖7G）。同時(shí)，研究在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FAM83A-FLAG，并證實(shí)FAM83A與RAF1之間存在相互作用（圖7H–I）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該相互作用，研究在AML12細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)源性免疫沉淀分析，發(fā)現(xiàn)FAM83A可與總RAF1蛋白和磷酸化RAF1發(fā)生蛋白-蛋白相互作用（圖7J–L）。這些結(jié)果為FAM83A與RAF1之間存在物理結(jié)合提供了有力證據(jù)。

圖7 FAM83A與RAF1發(fā)生物理相互作用并激活EGFR介導(dǎo)的RAF1-ERK信號(hào)軸。
（A–B）在有或無(wú)EGF處理（50 ng/mL）條件下，采用特異性抗體檢測(cè)FAM83A過(guò)表達(dá)（A）或敲低（B）的AML12細(xì)胞中P-MAPK底物。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（C–D）檢測(cè)FAM83A過(guò)表達(dá)（C）或敲低（D）的AML12細(xì)胞中RAF1和MAPK信號(hào)通路。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（E–F）檢測(cè)HFD喂養(yǎng)15周（OE）或14周（LKO）小鼠肝組織中RAF1和MAPK信號(hào)通路。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（n=4）。*p<0.05，**p<0.01；分別采用雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)（E）或單因素方差分析并進(jìn)行Bonferroni多重比較（F）。（G）分子對(duì)接顯示FAM83A與RAF1之間的相互作用位點(diǎn)。（H–I）在FAM83A過(guò)表達(dá)的HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)評(píng)估FAM83A與RAF1之間的物理相互作用。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（J–L）在AML12細(xì)胞中，通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM83A與RAF1/p-RAF1之間的內(nèi)源性相互作用。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

3.6 抑制RAF1或ERK信號(hào)可減弱FAM83A對(duì)脂質(zhì)代謝的影響

為進(jìn)一步明確FAM83A通過(guò)與RAF1相互作用激活ERK信號(hào)并調(diào)控脂質(zhì)代謝，本研究首先采用RAF1藥理性抑制劑索拉非尼（20 μM）處理FAM83A過(guò)表達(dá)的AML12細(xì)胞。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A可激活RAF1/ERK信號(hào)軸，而索拉非尼處理可減弱這一作用（圖8A）。與此同時(shí)，索拉非尼可抑制FAM83A誘導(dǎo)的膽固醇合成相關(guān)蛋白（LDLR、HMGCR）和脂肪酸合成相關(guān)蛋白（ACC1、FASN）表達(dá)升高（圖8B）。

接下來(lái)，研究采用經(jīng)典ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059處理FAM83A過(guò)表達(dá)的AML12細(xì)胞。類似地，ERK抑制劑PD98059通過(guò)抑制磷酸化ERK，消除了FAM83A促進(jìn)膽固醇和脂肪酸合成相關(guān)蛋白（FASN、ACC1、HMGCR、LDLR）表達(dá)的作用（圖8C–D）。同時(shí)，索拉非尼或PD98059處理還可阻止FAM83A過(guò)表達(dá)AML12細(xì)胞中脂滴形成，提示FAM83A促進(jìn)脂質(zhì)合成依賴于RAF1/ERK信號(hào)軸（圖8E）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)AM83A與RAF1發(fā)生物理結(jié)合，隨后激活ERK信號(hào)通路，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成上調(diào)。

圖8 RAF1和ERK抑制劑可逆轉(zhuǎn)FAM83A促進(jìn)脂質(zhì)合成的作用。
（A–B）FAM83A過(guò)表達(dá)AML12細(xì)胞經(jīng)RAF1抑制劑索拉非尼（20 μM）處理后，RAF1-ERK信號(hào)通路（左）及脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)（右）變化。（C–D）FAM83A過(guò)表達(dá)AML12細(xì)胞經(jīng)ERK抑制劑PD98059（20 μM）處理后，RAF1-ERK信號(hào)通路（左）及脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)（右）變化。（E）Fam83A過(guò)表達(dá)AML12細(xì)胞經(jīng)ERK抑制劑（20 μM PD98059）或RAF1抑制劑（20 μM索拉非尼）處理后檢測(cè)脂滴形成（比例尺：50 μm）。數(shù)據(jù)代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

【Citation】:Zhou Y, Dai Y, Qin M, Li Y, Shi L, Chen H, Fan H, Yu Y, Guo L, Xiong J. FAM83A acts as an amplifier for lipogenic signaling to facilitate the pathogenesis of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis.Metabolism.2026;175:156462.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究闡明了FAM83A在調(diào)控RAF1-ERK信號(hào)軸中的新作用，該信號(hào)軸在MAFLD/MASH及代謝性血脂異常的發(fā)病過(guò)程中具有關(guān)鍵意義。FAM83A通過(guò)結(jié)合RAF1并增強(qiáng)ERK激活，在MAFLD背景下驅(qū)動(dòng)脂質(zhì)堆積。這些發(fā)現(xiàn)不僅加深了對(duì)MAFLD/MASH分子機(jī)制的理解，也提示FAM83A可能是一個(gè)具有前景的治療靶點(diǎn)。未來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)針對(duì)FAM83A介導(dǎo)信號(hào)通路的特異性抑制劑，并評(píng)估其逆轉(zhuǎn)MAFLD/MASH病理進(jìn)程及改善不良循環(huán)脂質(zhì)譜的潛力。

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