Mol Cell丨eccDNA形成的新機(jī)制——DNA損傷誘導(dǎo)i-loop形成

撰文丨啾啾椰

eccDNA( extrachromosomal circular DNA ， 染色體外環(huán)狀 DNA ) 是一種游離于真核生物細(xì)胞核染色體之外的環(huán)狀 DNA 分子，廣泛存在于各種正常和腫瘤細(xì)胞中【1】。 eccDNA 大小從 幾十個(gè)堿基到數(shù)十萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)不等，通常為單鏈或雙鏈閉合環(huán)狀。 這種 DNA 在 正常細(xì)胞中普遍存在，但在腫瘤細(xì)胞中拷貝數(shù)顯著升高。 由于結(jié)構(gòu)開放 、轉(zhuǎn)錄活性高， 又 常攜帶完整的癌基因（如 MYC 、 EGFR ）， eccDNA 能 通過(guò)增加拷貝數(shù)在多種癌癥中驅(qū)動(dòng)基因的過(guò)度活化 。而 因其特異性地存在于癌細(xì)胞且在血液中較為穩(wěn)定， eccDNA 有望成為癌癥液體活檢和伴隨診斷的分子標(biāo)志物【2】。

過(guò)去的模型認(rèn)為， eccDNA 主要來(lái)自雙鏈斷裂后的 DNA 片段重新連接 ， 也就是染色體發(fā)生 DSB ，斷裂片段被切下來(lái)，再通過(guò)連接形成環(huán)狀 DNA【3】。然而，這個(gè)模型不能很好解釋 為什么 大 量 eccDNA 來(lái)自重復(fù)序列區(qū)域，比如端粒、著絲粒附近的 alpha satellite 、 rDNA 和轉(zhuǎn)座元件等【4】。重復(fù)序列天然具有同源性，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為容易發(fā)生重組，但具體怎樣從重復(fù)序列變成 eccDNA 并不清楚。

近日，來(lái)自意大利技術(shù)研究院的YlliDoksani團(tuán)隊(duì) 在Molecular Cell上發(fā)表題為Damage-inducedi-loops generateeccDNAfrom repetitive elements的文章， 提出了一個(gè)新的機(jī)制：單鏈DNA損傷可以在重復(fù)序列中誘導(dǎo)internal loop(i-loop)，這些i-loop隨后被切除，形成eccDNA。

文章首先要解決的問(wèn)題是， 重復(fù)序列中的 eccDNA 是否一定需要雙鏈斷裂產(chǎn)生？作者分別用 sgRNA 靶向端粒重復(fù)序列和 alpha satellite 重復(fù)序列，然后用二維凝膠電泳檢測(cè) DNA 結(jié)構(gòu)。當(dāng)單鏈損傷被引入端粒或 alpha satellite 區(qū)域后，二維凝膠上出現(xiàn)了 代表 i -loop 結(jié)構(gòu)的弧形信號(hào)（圖2）。 作者還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)用 Cas9 或 TRF1-FokI 產(chǎn)生 DSB （雙鏈斷裂） 時(shí)，并不能有效誘導(dǎo) i -loop ，這說(shuō)明 i -loop 形成主要由單鏈損傷驅(qū)動(dòng)，而不是 DSB 的副產(chǎn)物。

圖 2: 單鏈 DNA 損傷后，重復(fù)序列區(qū)域的 i -loop 結(jié)構(gòu)積累。

接下來(lái)， 作者 把分離出來(lái)的基因組 DNA 用低劑量 DNase I 處理。低劑量 DNase I 可以產(chǎn)生 nick 或短的單鏈 gap 。結(jié)果顯示，在 alpha satellite 區(qū)域，同樣可以檢測(cè)到 damage-dependent 的 i -loop 弧形信號(hào)，而泛基因組探針并沒(méi)有看到類似信號(hào)。這說(shuō)明 i -loop 并不會(huì)出現(xiàn)在全部基因組中，而在重復(fù)序列中特意出現(xiàn)； 當(dāng)重復(fù)序列中兩個(gè)位置暴露出互補(bǔ)的單鏈區(qū)域時(shí)，它們可能靠同源配對(duì)就能形成 i -loop 。

為了直接看到這些 i -loop 結(jié)構(gòu)，作者使用電子顯微鏡觀察 alpha satellite DNA 。 電子顯微鏡觀察顯示，在損傷后的 alpha satellite 富集樣品中，不僅有 i -loop ，還有明顯增加的環(huán)狀 DNA 分子（圖3），并且這種環(huán)狀分子可以被增強(qiáng)的 DNA 連接酶增加 。 這說(shuō)明 這些 i -loop 真的變成 了 eccDNA 。

圖 3: 電鏡檢測(cè)到的受損重復(fù)序列處 eccDNA 的形成

然后作者把問(wèn)題推進(jìn)到一個(gè)更生理相關(guān) 的 細(xì)胞凋亡 場(chǎng)景 ，發(fā)現(xiàn) 凋亡過(guò)程中 i -loop 形成與 caspase 活性相關(guān)，很可能與 CAD 引起的 DNA 單鏈損傷或 gap 積累有關(guān)。 他們使用 長(zhǎng)讀長(zhǎng) Nanopore 測(cè)序做全基因組層面的 eccDNA 來(lái)源分析 ， rDNA 、 satellite DNA 、 retrotransposons 等重復(fù)元件在 eccDNA 中顯著富集。 也據(jù)此提出， 重復(fù)序列由于具有同源性，在單鏈損傷后更容易形成 i -loop 并被切除，因此是 eccDNA 的重要來(lái)源。 最后，作者把這個(gè)機(jī)制聯(lián)系到腫瘤中的大型 ec c DNA 。 由于大型 ec c DNA 超過(guò)了二維凝膠和 EM 可以直接觀察的大小范圍，作者沒(méi)有直接檢測(cè)這些結(jié)構(gòu)，而是分析了公開腫瘤 ec c DNA 數(shù)據(jù)中的斷點(diǎn)附近是否富集重復(fù)序列。 他們 發(fā)現(xiàn) e c cDNA 事件中，斷點(diǎn)兩側(cè)更容易出現(xiàn)同一家族的重復(fù)元件 。 作者因此提出，i-loop機(jī)制不僅能解釋小型eccDNA的產(chǎn)生，也可能通過(guò)遠(yuǎn)距離重復(fù)序列相互作用，參與更大型eccDNA的形成。

綜合來(lái)看，這篇文章提出了一個(gè)區(qū)別于傳統(tǒng)DSB-ligation模型的eccDNA生成機(jī)制。傳統(tǒng)模型強(qiáng)調(diào)雙鏈斷裂后DNA片段重新連接，而這篇文章強(qiáng)調(diào)單鏈損傷在重復(fù)序列中暴露同源區(qū)域，使DNA形成i-loop，隨后i-loop被切除并封閉，生成eccDNA。這個(gè)機(jī)制的重要性在于，SSB和gap在細(xì)胞中遠(yuǎn)比DSB常見，而且人類基因組中大約一半由重復(fù)序列構(gòu)成，因此這種機(jī)制可能非常普遍。

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Shibata, Y., Kumar, P., Layer, R., Willcox, S., Gagan, J.R., Griffith, J.D., and Dutta, A. (2012). Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues.Science336, 82–86. https://doi.org/10. 1126/science.1213307.

2. Turner, K.M., Deshpande, V., Beyter, D., Koga, T., Rusert, J., Lee, C., Li, B., Arden, K., Ren, B., Nathanson, D.A., et al. (2017). Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity.Nature543, 122–125. https://doi.org/10.1038/nature21356.

3. Stephens, P.J., Greenman, C.D., Fu, B., Yang, F., Bignell, G.R., Mudie, L.J., Pleasance, E.D., Lau, K.W., Beare, D., Stebbings, L.A., et al. (2011). Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development.Cell144 , 27–40. https://doi.org/10.1016/j. cell.2010.11.055.

4. Jones, R.S., and Potter, S.S. (1985). Characterization of cloned human alphoid satellite with an unusual monomeric construction: evidence for enrichment in HeLa small polydisperse circular DNA.Nucleic Acids Res.13, 1027–1042. https://doi.org/10.1093/nar/13.3.1027.

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