PNAS I RIPK1泛素化“生死開關”被揭示：一端掌控胚胎發育，一端點燃系統性炎癥 (章海兵-中國科學院上海營養與健康研究所)

2026年4月7日，中國科學院上海營養與健康研究所章海兵團隊 在PNAS（中科院1區，IF=9.1）在線發表題為 “RIPK1 ubiquitination regulates its kinase-independent function in development and inflammation” 的研究論文。該研究聚焦 RIPK1泛素化調控細胞死亡與炎癥反應 這一免疫炎癥領域關鍵問題，圍繞 RIPK1 K376 位點泛素化在胚胎發育、炎癥小體活化和系統性炎癥中的作用及機制展開系統研究。

研究團隊此前發現，RIPK1 K376 位點泛素化缺失會導致小鼠胚胎致死，并伴隨過度細胞死亡。為進一步區分 RIPK1 激酶活性和支架功能在該過程中的作用，本研究在 Ripk1^K376R/K376R 小鼠基礎上引入激酶失活突變 D138N，構建 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 雙突變小鼠。結果顯示，D138N 突變可完全挽救 K376R 小鼠的胚胎致死，說明 K376 位點泛素化缺失導致的胚胎死亡主要依賴 RIPK1 激酶過度活化。

值得關注的是，雖然雙突變小鼠能夠存活至成年，但出生后出現明顯系統性炎癥，主要表現為皮膚和肝臟炎癥、脾腫大、中性粒細胞增加以及炎癥相關基因上調。進一步遺傳學分析顯示，敲除 Caspase-1/11 可顯著緩解炎癥，而敲除 Trif 無法改善，提示該炎癥過程主要由炎癥小體活化驅動，而非經典 TRIF 信號介導。

機制上，該研究發現，RIPK1 K376R 突變可通過激酶非依賴性、支架依賴性方式激活內源性 NLRP3 炎癥小體，促進 Caspase-1 活化和 IL-1β 分泌。進一步分析顯示，該過程與 ROS 增加、線粒體功能異常和花生四烯酸代謝重編程密切相關。Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 巨噬細胞中 PGE2 和 PGD2 等前列腺素顯著升高，COX1/2 抑制劑可抑制 IL-1β 分泌并改善 LPS 誘導的小鼠死亡，說明花生四烯酸-COX-前列腺素通路是 RIPK1 支架驅動炎癥的重要代謝軸。

進一步研究揭示，RIPK1 可與 RIPK3 和 COX2 形成復合物，促進 COX2 活化和 PGE2 生成。該過程依賴 RIPK3 的 RHIM 結構域，但不依賴 RIPK3 激酶活性，也不依賴壞死性凋亡執行分子 MLKL。與此一致，敲除 Ripk3 而非 Mlkl 可顯著緩解雙突變小鼠的系統性炎癥，提示存在一條 RIPK1/RIPK3-COX2-PGE2-NLRP3-IL-1β 的非經典炎癥通路。

該研究系統闡明了 RIPK1 K376 位點泛素化在發育和炎癥中的雙重調控作用：一方面，RIPK1 激酶活性驅動胚胎發育階段的細胞死亡；另一方面，RIPK1 支架功能可在成年階段通過代謝重編程和炎癥小體活化誘發系統性炎癥。該發現為理解 RIPK1 相關炎癥性疾病提供了新的機制框架，也為開發選擇性靶向 RIPK1 支架功能或下游炎癥代謝軸的新型抗炎策略提供了重要理論依據。

亮點：

RIPK1 是細胞凋亡、壞死性凋亡和炎癥反應的核心調節因子，其不同功能取決于其支架作用和激酶活性。RIPK1 的翻譯后修飾，尤其是泛素化，對于控制其活化至關重要。

本研究發現，RIPK1 第376位賴氨酸泛素化缺失不僅通過 RIPK1 激酶依賴性細胞死亡導致胚胎致死，還可在成年小鼠中通過一種激酶非依賴性、支架依賴性機制驅動系統性炎癥。這種炎癥反應由 RIPK3 依賴性炎癥小體活化及隨后的 IL-1β 分泌介導，同時 TNFR1 誘導的細胞死亡也參與其中。

這些發現揭示了 RIPK1 在發育和炎癥調控中的雙重作用，并為理解 RIPK1 相關炎癥性疾病的發病機制提供了新的概念框架。

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【摘要】

受體相互作用蛋白激酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）是細胞死亡和炎癥反應的關鍵調控因子，其活化受到多種翻譯后修飾調控。此前研究表明，RIPK1 第376位賴氨酸（K376）的泛素化可在體內外抑制細胞凋亡和壞死性凋亡，但其在炎癥中的作用仍不明確。

本研究在 Ripk1^K376R/K376R 小鼠中引入激酶失活突變 D138N。值得注意的是，Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死表型，但出生后會發生系統性炎癥。進一步研究發現，聯合敲除 Caspase-1/11 可顯著緩解這種炎癥，而敲除 Trif 則不能，提示炎癥小體活化在其中發揮關鍵作用。

機制上，RIPK1 K376 位點泛素化缺失可促進依賴 RIPK1 激酶活性的細胞死亡，這是 Ripk1^K376R/K376R 小鼠胚胎致死的原因。同時，K376R 突變還可通過觸發內源性 NLRP3 炎癥小體活化和下游 IL-1β 分泌，驅動 RIPK1 激酶非依賴性炎癥反應。

進一步研究發現，RIPK1 通過 RIPK3 依賴性機制促進這一過程。與此一致，敲除 Ripk3 而非 Mlkl 可改善炎癥，提示存在一條不依賴壞死性凋亡的炎癥軸。

綜上，本研究表明，RIPK1^K376R 突變體不僅在胚胎發育過程中誘導依賴激酶活性的細胞死亡，還可在成年階段通過 RIPK3 介導的代謝重編程激活 NLRP3 炎癥小體，從而促進激酶非依賴性、支架功能驅動的炎癥反應。

關鍵詞

RIPK1；Caspase-1/11；NLRP3炎癥小體；泛素化

01

研究背景及科學問題

受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調控細胞死亡、炎癥和免疫反應。在人類中，RIPK1 雙等位基因功能缺失突變可導致嚴重免疫缺陷以及早發炎癥性疾病，如炎癥性腸病和關節炎。在小鼠中，Ripk1 缺失會導致圍產期死亡，這主要是由于 FADD/Caspase-8 介導的異常凋亡，以及 RIPK3/MLKL 軸驅動的壞死性凋亡失控所致。

RIPK1 的激酶活性對于 RIPK1 依賴性凋亡和壞死性凋亡均不可或缺。然而，在小鼠中通過 D138N 或 K45A 等激酶失活突變使 RIPK1 失去催化活性，并不會影響正常存活。事實上，這類激酶突變小鼠對 TNFα 誘導的系統性炎癥反應綜合征及多種神經退行性疾病具有抵抗作用，提示 RIPK1 激酶活性不僅參與細胞死亡，也參與病理性炎癥過程。

與此同時，Caspase-8 對 RIPK1 的切割是防止其異常活化的重要檢查點。一旦 RIPK1 不能被 Caspase-8 正常切割，就會引發自發性炎癥和致死表型，而抑制 RIPK1 激酶活性可部分挽救這一表型。這些結果提示，活化的 RIPK1 可能通過超越其激酶活性的機制促進炎癥。

遺傳學研究顯示，在 RIPK1 D324A 突變背景下引入激酶失活突變可完全挽救胚胎致死，但雙突變小鼠最終仍會死亡，且不能存活至斷奶后。這說明活化的 RIPK1 可通過激酶非依賴性信號通路介導炎癥功能。另有研究顯示，在凋亡和壞死性凋亡被抑制時，催化失活的 Caspase-8 可通過其支架功能促進細胞焦亡。然而，RIPK1 是否也可通過支架功能參與炎癥小體活化或炎癥重編程，目前仍不清楚。

RIPK1 的泛素化狀態對于其多種功能轉換至關重要。既往研究報道，RIPK1 可在多個位點發生泛素化，包括 K376、K115、K627 等，其中 K376 位點在人源 RIPK1 中對應 K377，對調控 RIPK1 活化尤為關鍵。體外研究表明，K377R 突變會抑制 TNFα 介導的 NF-κB 活化，并促進 TNFα 誘導的凋亡。

研究者此前及其他團隊已證明，表達 RIPK1 K376R 突變體的小鼠會在胚胎第12.5天發生胚胎致死，并伴隨胚胎組織和卵黃囊中過度細胞死亡。通過遺傳雜交策略，敲除凋亡和壞死性凋亡相關基因，如 Fadd/Ripk3、Fadd/Mlkl 或 Casp8/Ripk3，可完全挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死，提示 RIPK1 K376R 在胚胎發育中同時促進凋亡和壞死性凋亡。

雖然體外實驗顯示 RIPK1 K376R 誘導的細胞死亡依賴其激酶活性，但給予 RIPK1 激酶抑制劑 Nec-1 僅能將胚胎死亡從 E12.5 延遲至 E13.5。因此，RIPK1 K376R 突變引起的胚胎致死是否真正依賴激酶活性仍不明確。

本研究構建了 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 雙突變小鼠模型，在 K376R 背景下引入激酶失活 D138N 突變。結果發現，該雙突變小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死，但出生后會發生自發性系統性炎癥。

進一步遺傳學分析顯示，這種炎癥可被 Caspase-1/11 缺失挽救，而不能被 TRIF 缺失挽救，提示炎癥小體內源性活化在其中發揮關鍵作用。機制上，RIPK1 K376R 突變既可驅動依賴激酶活性的細胞死亡，也可驅動激酶非依賴性炎癥反應。當活化的 RIPK1 通過 RIPK3 重編程花生四烯酸代謝時，可導致前列腺素過量產生，進而激活內源性 NLRP3 炎癥小體并促進 IL-1β 分泌。

總體而言，本研究揭示，RIPK1 K376R 突變體不僅在胚胎發生期間促進依賴激酶活性的細胞死亡，也可在出生后促進激酶非依賴性炎癥反應。

02

重要發現及亮點

1. Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠胚胎致死，但會發生系統性炎癥

研究者此前及其他團隊已經證明，Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死可通過同時消除凋亡和壞死性凋亡相關基因得到完全挽救；同時，在小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中，RIPK1 K376R 誘導的細胞死亡依賴其激酶活性。然而，Nec-1 給藥僅能將胚胎死亡從 E12.5 延遲至 E13.5。為進一步解析 RIPK1 激酶活性在 RIPK1^K376R 誘導胚胎致死中的作用，研究構建了攜帶 K376R 和 D138N 雙突變的敲入小鼠，即 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N，簡稱 Ripk1^K,D/K,D。其中關鍵激酶殘基 D138 被天冬酰胺 N138 替代。

與 E12.5 即死亡的 Ripk1^K376R/K376R 小鼠不同，Ripk1^K,D/K,D 小鼠可存活至成年，說明 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死主要由 RIPK1 激酶過度活化驅動。

為研究 RIPK1 激酶失活對 K376R 突變誘導細胞死亡的影響，研究者使用 Ripk1^+/+、Ripk1^K376R/K376R 和 Ripk1^K,D/K,D 小鼠來源的永生化 MEF 細胞，并給予不同細胞死亡刺激。結果顯示，Ripk1^K376R/K376R MEF 對 TNFα+BV6 誘導的凋亡，以及 TNFα+BV6+zVAD 誘導的壞死性凋亡高度敏感；而 Ripk1^K,D/K,D MEF 可抵抗這兩類細胞死亡。

進一步研究 TNFα 刺激后 TNF-RSC 復合物發現，與 Ripk1^K376R/K376R MEF 相比，Ripk1^K,D/K,D MEF 中升高的 p-RIPK1(S166) 被抑制，但降低的 RIPK1 泛素化并未恢復。相應地下游細胞死亡執行標志物，包括 cleaved Caspase-3、p-MLKL 和 p-RIPK3，在 Ripk1^K,D/K,D MEF 中均下降。

由于 RIPK1 對 NF-κB 信號的調控主要依賴其泛素化功能而非激酶活性，研究發現 Ripk1^K,D/K,D MEF 在 TNFα 刺激下仍表現出與 Ripk1^K376R/K376R MEF 類似的 NF-κB 活化缺陷。這說明 D138N 激酶失活可抑制 RIPK1 活化并保護細胞免于死亡，但不能恢復 TNFα 處理 Ripk1^K376R/K376R 細胞中下降的 RIPK1 泛素化。

盡管 Ripk1^K,D/K,D 小鼠可以存活，但其表現出進行性生長遲緩和體重降低。組織病理學分析顯示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠在皮膚和肝臟中出現自發性炎癥，而肺和腸道組織未見明顯炎癥。2周齡時 Ripk1^K,D/K,D 小鼠脾臟外觀正常，但8周齡時出現脾腫大。免疫細胞分析顯示，脾臟中 CD3^+ T 細胞減少，B220^+ B 細胞和 Gr-1^+CD11b^+ 中性粒細胞增加，提示發生系統性炎癥反應。

皮膚組織 RNA-seq 顯示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠炎癥相關基因，如 Il1b、Il6、Cxcl2、Acod1，以及細胞死亡相關基因，如 Casp4、Nlrp3、Ripk3、Mlkl 顯著上調。差異基因聚類分析發現 subcluster_1 基因集在 Ripk1^K,D/K,D 皮膚組織中顯著上調，其功能富集主要與免疫反應和免疫細胞募集通路相關。RT-PCR 進一步驗證了代表性炎癥因子的表達升高，而 Tnfa 表達未發生明顯變化。

為檢測 RIPK1 支架蛋白劑量是否影響炎癥，研究者分析了缺失一個 RIPK1 等位基因的 Ripk1^K,D/? 小鼠。結果顯示，該小鼠表型正常，未出現 Ripk1^K,D/K,D 小鼠中的炎癥病理，炎癥和細胞死亡基因表達也恢復正常。這說明需要兩個拷貝的 RIPK1 支架蛋白，才能通過激酶非依賴性功能驅動系統性炎癥。

圖1 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠發生系統性炎癥

A：構建 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠的策略示意圖；
B：Ripk1^K376R,D138N/+,+ 小鼠互交后斷奶后代數量統計；
C：出生后第14天不同基因型小鼠代表性圖像；
D：出生后第14天不同基因型小鼠皮膚切片的 H&E、IHC（CD45）和免疫熒光染色圖像，其中 K6 為綠色、K10 為紅色；
E：8周齡小鼠脾臟/體重比值，以及脾臟中 Gr-1^+CD11b^+、B220^+、CD3^+、CD4^+ 和 CD8^+ 細胞數量統計；
F：RNA-seq 火山圖顯示差異表達基因；
G：實時 PCR 檢測皮膚組織炎癥相關基因表達；
H：不同基因型皮膚組織中 subcluster_1 基因集趨勢圖。
K,D 表示 Ripk1^K376R,D138N。數據以均數 ± SEM 表示，采用雙尾 Student’s t 檢驗；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2. Caspase-1/11 信號加重 RIPK1 支架驅動的系統性炎癥

鑒于 RIPK1 激酶失活突變可抑制凋亡和壞死性凋亡，而 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮膚和血清中 IL-1β 表達升高，研究進一步檢測焦亡相關信號通路是否被活化。

Western blot 結果顯示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮膚中 Caspase-11、cleaved GSDMD 和 cleaved Caspase-1 水平均升高，但其他組織中未出現相同變化。

由于 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮膚中存在炎癥小體活化，研究者將該小鼠分別與 Trif^?/? 和 Casp1/11^?/? 小鼠雜交，以確定焦亡通路在皮膚炎癥中的作用。組織學結果顯示，敲除 Casp1/11 而非 Trif，可顯著減少皮膚和肝臟中的表皮增厚及免疫細胞浸潤。

在8周齡時，Casp1/11 缺失的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠還表現出脾腫大減輕和中性粒細胞積累減少。考慮到焦亡在 LPS 誘導內毒素休克中的關鍵作用，研究者進一步給予 Ripk1^K,D/K,D 小鼠致死劑量 LPS，以評估 RIPK1 支架功能在該模型中的作用。結果顯示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠在 LPS 誘導內毒素休克模型中死亡率顯著高于野生型小鼠。

既往研究報道，敲除 Trif 或 Casp1/11 均可增強小鼠對 LPS 誘導內毒素休克的抵抗力。然而在本研究中，只有 Casp1/11 缺失，而不是 Trif 缺失，能夠降低 Ripk1^K,D/K,D 小鼠在 LPS 誘導內毒素休克中的高敏感性。以上結果表明，Casp1/11 介導的炎癥小體活化，而非 TRIF 信號，是 RIPK1 支架依賴性炎癥和 LPS 內毒素休克易感性的主要貢獻因素。

圖2 Caspase-1/11 信號參與 RIPK1 支架介導的系統性炎癥

A：Western blot 檢測出生后第14天不同基因型小鼠皮膚組織中相關蛋白表達；
B：出生后第14天不同基因型小鼠代表性圖像；
C：2周齡不同基因型小鼠皮膚和肝臟切片代表性圖像；
D：2周齡不同基因型小鼠皮膚表皮厚度、炎癥面積和 CD45^+ 細胞數量統計；
E：脾臟重量定量；
F：8周齡不同基因型小鼠脾臟代表性圖像；
G–H：流式細胞術檢測8周齡不同基因型小鼠脾細胞中 Gr-1 和 CD11b 陽性細胞；
I：LPS（50 mg/kg）攻擊后不同基因型小鼠生存曲線。
生存曲線比較采用 Log-Rank（Mantel–Cox）檢驗；D、E、H 圖數據以均數 ± SEM 表示，采用雙因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3. RIPK1^K376R 突變促進內源性 NLRP3 炎癥小體活化

基于 Casp1/11 敲除可顯著挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠系統性炎癥這一發現，研究者提出假設：RIPK1 的支架功能可促進 Casp1/11 介導的炎癥小體活化。

為驗證這一點，研究首先檢測 LPS 刺激后 Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^+/+ 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的細胞因子產生。結果顯示，與對照組相比，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 分泌顯著更高水平的 IL-1β，而 IL-6 和 TNFα 并未升高。Caspase-1 抑制劑 YVAD 可顯著消除升高的 IL-1β，說明這一過程依賴 Caspase-1 活化。

鑒于 NLRP3 依賴性炎癥小體可激活 Caspase-1，研究進一步使用 NLRP3 特異性抑制劑 MCC950 進行驗證。結果顯示，在 LPS 刺激的 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中，MCC950 可抑制 Caspase-1 活化和 IL-1β 分泌，表明這一過程由 NLRP3 炎癥小體介導。

不過，在經典 NLRP3 炎癥小體刺激條件下，即 LPS 加 Nigericin，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 的炎癥小體活化反而低于 Ripk1^+/+ 對照細胞，這可能與 NF-κB 啟動階段缺陷導致 NLRP3 表達不足有關。這也與 Trif 敲除不能挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠炎癥表型的結果一致。總體來看，這些結果提示 RIPK1^K376R 突變可通過支架依賴方式促進內源性 NLRP3 炎癥小體活化和 IL-1β 分泌。

為探索 RIPK1 突變如何驅動內源性 NLRP3 炎癥小體活化，研究對差異表達基因集 subcluster_1 進行富集分析，發現其不僅富集于免疫活化通路，也富集于活性氧（ROS）產生相關通路。實際檢測顯示，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 在基礎狀態和 LPS 刺激后均產生更高水平 ROS。由于 ROS 是內源性 NLRP3 炎癥小體的激活因子，研究進一步使用 ROS 清除劑 BHA 和 NAC 處理細胞，結果顯示二者均可抑制 LPS 刺激后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中過量 IL-1β 分泌。

由于線粒體是 ROS 的主要來源之一，研究者進一步評估線粒體完整性和功能。形態學分析顯示，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中線粒體碎片化增加；TMRE 和 JC-1 染色顯示線粒體膜電位顯著下降，提示發生線粒體去極化。相應地，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中線粒體 ROS 在基礎狀態和 LPS 刺激后均升高。使用線粒體 ROS 清除劑 MitoTEMPO 可部分降低 IL-1β 分泌，說明線粒體 ROS 部分參與 RIPK1 支架下游的內源性 NLRP3 炎癥小體活化。

圖3 RIPK1^K376R 突變體通過激酶非依賴性功能激活內源性 NLRP3 炎癥小體

A：Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 經 LPS（100 ng/mL）刺激18 h 后，檢測培養上清中 IL-1β、IL-6 和 TNFα 釋放；
B：在有或無 Caspase-1 抑制劑 YVAD（20 μM）的條件下，檢測 LPS 刺激18 h 后 IL-1β 釋放；
C–D：在有或無 NLRP3 抑制劑 MCC950（1 μM）的條件下，LPS 刺激24 h 后檢測 IL-1β 釋放和 cleaved Caspase-1 水平；
E–F：GO 富集分析中超氧化物代謝過程相關差異基因熱圖，以及 Reactome 富集分析中吞噬細胞 ROS/RNS 產生相關差異基因熱圖；
G：LPS 刺激不同時間后，采用 DCF-DA 染色檢測 BMDMs 中 ROS 生成；
H：BHA（200 μM）和 NAC（5 mM）處理后，檢測 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平；
I：流式細胞術分析 LPS（100 ng/mL）刺激6 h 后 BMDMs 中 MitoSOX 信號；
J：MitoTEMPO 處理后，檢測 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平。
數據以均數 ± SEM 表示。A 圖采用雙尾 Student’s t 檢驗；B、C、G–J 圖采用雙因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

4. RIPK1 驅動花生四烯酸代謝重塑，促進前列腺素過量產生

研究數據表明，BHA 可強烈抑制 IL-1β 分泌，而 NAC 僅發揮部分抑制作用，說明 ROS 只是內源性 NLRP3 炎癥小體活化的部分原因。

對 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 進行非靶向代謝組學分析發現，脂質代謝是最顯著失調的通路。LipidTOX Red 染色進一步證實，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 在 LPS 刺激后出現過量脂質積累。藥理學阻斷關鍵脂質代謝通路可顯著減少 IL-1β 分泌。

既往研究顯示，脂肪酸氧化參與炎癥小體活化，但本研究發現，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中脂肪酸攝取和 HADHA 酶活性并無明顯變化，提示在該模型中占主導的是其他脂質代謝通路。

通路富集分析發現，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝顯著上調，其特征是通過 PLA2-COX1/2 信號增強前列腺素生成。考慮到 BHA 已知可抑制胞質型 PLA2（cPLA2），研究者推測 BHA 可能通過靶向 cPLA2 介導的 AA 代謝抑制 IL-1β 分泌。

為驗證這一點，研究使用針對 PLA2-COX1/2 信號不同組分的抑制劑。其中 MAFP 可抑制 cPLA2 和 iPLA2，BEL 靶向 sPLA2，CAY10650 是選擇性 cPLA2 抑制劑。結果顯示，MAFP 的抑制作用強于 CAY10650，而 BEL 無明顯作用，提示 sPLA2 不參與該過程，cPLA2 在 RIPK1 支架介導的 IL-1β 釋放中發揮重要作用。

隨后研究者使用選擇性 COX 抑制劑驗證下游 COX1/2 的作用。結果顯示，這些藥物均可強烈抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。

接著，研究探討 RIPK1^K376R 突變如何調控 AA 代謝以影響 IL-1β 分泌。LPS 刺激可使 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 AA 衍生代謝物，尤其是 PGE2 和 PGD2 顯著升高。雖然 IL-1β 可放大 PGE2 生成，但對 Ripk1^+/+、Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^K,D/K,D Casp1/11^?/? BMDMs 的分析顯示，Casp1/11 敲除雖然消除了 IL-1β 分泌，卻并未降低 PGE2 水平，說明 RIPK1 增強 AA 代謝和 PGE2 產生并不依賴 IL-1β 反饋。

為評估 RIPK1 活化突變是否普遍增強前列腺素合成，研究者在 RIPK1 敲除的永生化 BMDMs 中回補 RIPK1 突變體，包括 D324A、K376R 和 K612R。結果發現，在 LPS+Nec-1 條件下，所有突變體均較野生型 RIPK1 增強 PGE2 產生，說明 RIPK1 活化突變普遍增強支架依賴性 PGE2 生成。

既往研究顯示，PGE2 可通過 EP3 受體激活磷脂酶 C（PLC），隨后通過 IP3 受體增加細胞內 Ca^2+，并降低細胞內 cAMP。Ca^2+ 和 cAMP 均參與炎癥小體活化和 IL-1β 釋放。研究發現，EP3 抑制劑 L798106 可顯著降低 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌，提示 EP3 發揮關鍵作用。PLC 抑制劑 2-APB 和升高 cAMP 的 Forskolin 也均可顯著抑制 IL-1β 釋放。相比之下，PGD2 受體 DP1 抑制劑無明顯作用。

進一步地，研究者用 PGE2 處理 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D 細胞，發現 PGE2 可濃度依賴性增強 IL-1β 分泌。同時，PGE2 處理后 Ripk1^K,D/K,D 細胞 ROS 生成增加。與此一致，COX1/2 抑制劑吲哚美辛預處理可顯著挽救 LPS 誘導的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠死亡，證明 AA-COX1/2 信號是 RIPK1 依賴性炎癥的重要介質。

圖4 RIPK1 協調花生四烯酸代謝重塑

A：非靶向代謝組學 OPLS-DA 得分圖；
B：非靶向代謝組學差異代謝物火山圖；
C：差異代謝物 KEGG 富集分析及差異豐度評分，展示前20條通路；
D：花生四烯酸代謝差異代謝物熱圖及 VIP 值；
E–F：在花生四烯酸代謝相關抑制劑處理后，檢測 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平；
G：LPS 刺激不同時間后，檢測 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 培養上清中 PGE2 釋放；
H：在有或無相關抑制劑條件下，LPS 刺激9 h 后檢測 PGE2 釋放；
I：LPS 刺激9 h 后，不同基因型 BMDMs 培養上清中 PGE2 和 IL-1β 釋放；
J：在不同 RIPK1 回補 iBMDMs 中檢測 PGE2 釋放，并通過 Western blot 分析 RIPK1 蛋白水平；
K：在有或無相關抑制劑條件下，LPS 刺激16 h 后檢測 IL-1β 釋放；
L：LPS（50 mg/kg）攻擊前3 h 給予 PBS 或吲哚美辛（50 mg/kg）預處理的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠生存曲線。
生存曲線比較采用 Log-Rank（Mantel–Cox）檢驗；其余數據以均數 ± SEM 表示，采用單因素或雙因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

5. RIPK1/RIPK3 信號軸協調 COX2 活化

前述結果證明，RIPK1^K376R 突變可通過花生四烯酸-cPLA2-COX1/2-PGE2 軸促進支架依賴性 IL-1β 分泌。為進一步解析 RIPK1 支架功能如何調控該通路，研究首先檢測 cPLA2 活化狀態，即 p-cPLA2 水平。結果顯示，在短期或長期 LPS 刺激下，兩種基因型之間 p-cPLA2 水平均無明顯差異，提示 RIPK1 不直接調控 cPLA2 活化。

同樣，LPS 刺激后 COX1/2 蛋白表達也無明顯改變，但 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 COX 酶活性顯著升高。鑒于 COX2 抑制劑可強烈抑制 IL-1β 和 PGE2 分泌，研究者推測 RIPK1 可能直接調控 COX2。

在過表達 RIPK1 和 COX2 的 293T 細胞中進行共免疫沉淀實驗，證實二者存在相互作用。截短突變分析顯示，RIPK1 的激酶結構域介導其與 COX2 的結合。重要的是，激酶失活突變體 RIPK1^D138N 仍能保留與 COX2 的結合能力，說明這種相互作用依賴 RIPK1 支架功能，而不是其激酶活性。

考慮到 RIPK1 已知可通過支架功能與 RIPK3 相互作用，并且 Ripk1^K,D/K,D 皮膚組織中存在 RIPK1 與 RIPK3 結合，研究者進一步探討 RIPK3 是否參與 RIPK1 依賴性 COX2 調控。來自 Ripk1^+/+、Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^K,D/K,D Ripk3^?/? 小鼠的 BMDMs 顯示，RIPK3 缺失顯著降低 Ripk1^K,D/K,D 細胞中 PGE2 產生，說明該過程依賴 RIPK3。

過表達實驗顯示，RIPK3 而非其下游效應分子 MLKL 可與 COX2 相互作用。分子對接和突變實驗表明，RIPK3 的 RHIM 結構域，而不是其激酶活性，對于 RIPK3-COX2 結合至關重要。與此一致，RIPK3 激酶抑制并不能抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。

由于 RIPK3-RHIM 結構域主要與 RIPK1 的 RHIM 結構域相互作用，研究者推測 RIPK3 與 COX2 的結合可能通過 RIPK1 介導。使用 Ripk1 缺失細胞進一步分析后發現，在缺失 RIPK1 的情況下，RIPK3 無法與 COX2 相互作用，提示 RIPK3 RHIM 突變會破壞 RIPK1-RIPK3 結合，進而影響 RIPK3-COX2 相互作用。

既往研究顯示，COX2 活化需要二聚化。研究發現，LPS 刺激可促進 RIPK1-RIPK3-COX2 復合物形成，并誘導 COX2 二聚化。遺傳學敲除 Ripk3，而非 Mlkl，可顯著抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。此外，COX2 抑制劑塞來昔布可改善 LPS 攻擊 Ripk1^K,D/K,D 小鼠的生存率。

不過，COX2 抑制劑改善 LPS 誘導 Ripk1^K,D/K,D 小鼠死亡的效果弱于非選擇性 COX1/2 抑制劑吲哚美辛。這可能是因為 COX1 在 COX2 抑制后具有代償作用。由于 COX1 和 COX2 具有重疊的催化活性和結構相似性，COX1 是否也以 RIPK1 依賴方式參與該通路仍需進一步研究。

總體而言，這些結果表明，RIPK1 和 RIPK3 可通過支架依賴性相互作用協同調控 COX2 活化，促進 PGE2 和 IL-1β 產生。該機制依賴 RIPK3 的 RHIM 結構域，代表了 RIPK1-RIPK3 復合物在炎癥信號中一種激酶非依賴性、非經典功能。

圖5 RIPK1/RIPK3 與 COX2 形成復合物并促進其活化

A：LPS 刺激 BMDMs 中 COX 酶活性檢測；
B–C：293T 細胞轉染 HA-RIPK1/Flag-COX2 或 Flag-RIPK1/HA-COX2 后，采用抗 Flag 磁珠進行免疫沉淀并進行免疫印跡分析；
D：全長 RIPK1 及其截短突變體示意圖；
E：293T 細胞轉染 Flag 標記 RIPK1 或其截短突變體以及 HA-COX2 后，進行 Co-IP 分析；
F：293T 細胞轉染 Flag-RIPK1^WT 或 Flag-RIPK1^D138N 及 HA-COX2 后，檢測二者相互作用；
G：2周齡小鼠皮膚組織裂解液中 RIPK1 和 RIPK3 相互作用的 Co-IP 和 Western blot 分析；
H：在有或無相關抑制劑條件下，檢測不同基因型 BMDMs 經 LPS（100 ng/mL）刺激后的 PGE2 釋放；
I：293T 細胞轉染 Flag-RIPK3 或 Flag-MLKL 及 HA-COX2 后，檢測其相互作用；
J：293T 細胞轉染 Flag-RIPK3 或其突變體及 HA-COX2 后，進行 Co-IP 分析；
K：在有或無 RIPK3 抑制劑條件下，檢測不同基因型 BMDMs 經 LPS 刺激后的 IL-1β 釋放；
L：不同基因型 BMDMs 經 LPS 刺激9 h 后，檢測 RIPK1、RIPK3 和 COX2 復合物形成；
M：DSS 交聯實驗檢測 COX2 二聚體形成；
N：不同基因型 BMDMs 經 LPS 刺激16 h 后檢測 IL-1β 釋放；
O：LPS（40 mg/kg）攻擊前3 h 給予 PBS 或塞來昔布（50 mg/kg）預處理的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠生存曲線。
生存曲線比較采用 Log-Rank（Mantel–Cox）檢驗；A、H、K、N 圖數據以均數 ± SEM 表示，采用雙因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

6. RIPK3 而非 MLKL 介導 RIPK1^K376R 突變誘導的系統性炎癥

在明確 RIPK1 可通過 RIPK3 促進支架依賴性 IL-1β 分泌后，研究者進一步評估 RIPK3 是否在體內系統性炎癥中發揮關鍵作用。

在 Ripk1^K,D/K,D 小鼠中敲除 Ripk3，可顯著減少皮膚和肝臟中的免疫細胞浸潤，并緩解脾腫大和免疫紊亂。相反，敲除 Mlkl 并不能改善這些表型。同時敲除 Mlkl 和 Casp1/11 可恢復免疫浸潤，說明 MLKL 非依賴性通路參與該炎癥反應。

重要的是，Ripk3^?/? 而不是 Mlkl^?/? 可挽救 LPS 誘導的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠早期死亡。上述結果表明，RIPK1 介導的系統性炎癥依賴 RIPK3 驅動的炎癥信號，而非 MLKL 依賴性壞死性凋亡。

盡管 Ripk3 敲除可大幅挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠系統性炎癥，但仍殘留部分皮膚炎癥和表皮增生。皮膚組織 Western blot 分析顯示，Ripk1^K,D/K,D Ripk3^?/? 小鼠中仍存在凋亡信號。類似地，LPS 刺激的 Ripk1^K,D/K,D Ripk3^?/? BMDMs 中也可檢測到凋亡。這提示除 RIPK3 介導的炎癥外，凋亡也可能參與皮膚炎癥。

鑒于 TNFR1 信號是 RIPK1 介導凋亡的主要通路，研究進一步分析其在 Ripk1^K,D/K,D 皮膚炎癥中的作用。遺傳性敲除 Tnfr1 可顯著減少 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮膚和肝臟中的免疫細胞浸潤，并抑制皮膚組織中的凋亡信號和炎癥小體活化。此外，Tnfr1 敲除可部分改善 LPS 攻擊 Ripk1^K,D/K,D 小鼠的生存率。

綜上，RIPK1 支架依賴性系統性炎癥由 RIPK3 依賴性炎癥信號以及一條平行的 RIPK3 非依賴性、TNFR1 介導的凋亡機制共同驅動。

圖6 RIPK3 而非 MLKL 負責 RIPK1 支架介導的系統性炎癥

A：出生后第14天不同基因型小鼠皮膚切片的 H&E、IHC（CD45）和免疫熒光染色圖像，其中 K6 為綠色、K10 為紅色；
B：2周齡不同基因型小鼠皮膚表皮厚度、炎癥面積和 CD45^+ 細胞數量統計；
C：8周齡不同基因型小鼠脾臟重量，以及脾臟中 CD3^+ T 細胞、B220^+ B 細胞和 Gr-1^+CD11B^+ 細胞數量；
D：LPS（50 mg/kg）攻擊后不同基因型小鼠生存曲線；
E：Western blot 檢測不同基因型 P14 小鼠皮膚組織蛋白表達；
F：LPS 刺激18 h 后 BMDMs 蛋白表達的 Western blot 分析；
G：Western blot 檢測不同基因型 P14 小鼠皮膚組織蛋白表達。
D 圖生存曲線比較采用 Log-Rank（Mantel–Cox）檢驗；B、C 圖數據以均數 ± SEM 表示，采用雙因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

【Citation】:Li M, Liu J, Xing M, Liu H, Wang L, Wu X, Ou Y, Zhao X, Wang Y, Xie Y, Zhang H, Wu Z, Hao J, Li H, Li Y, Zhang H. RIPK1 ubiquitination regulates its kinase-independent function in development and inflammation.Proc Natl Acad Sci U S A.2026Apr 14;123(15):e2520356123.

【貢獻】★★★★★

本研究揭示了 RIPK1 泛素化在調控其發育和炎癥功能中的雙重作用。

首先，RIPK1 K376 位點泛素化缺失會導致 RIPK1 激酶過度活化，進而誘導凋亡和壞死性凋亡，造成胚胎期致死。通過在 K376R 背景下引入 D138N 激酶失活突變，可完全挽救這一胚胎致死表型，說明 RIPK1 K376R 介導的胚胎死亡主要依賴 RIPK1 激酶活性。

其次，盡管激酶失活可避免胚胎死亡，Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠出生后仍出現系統性炎癥，尤其表現于皮膚和肝臟。該炎癥并非由 RIPK1 激酶活性驅動，而是依賴 RIPK1 的支架功能，并需要兩個拷貝的 RIPK1 支架蛋白參與。

機制上，RIPK1 K376R 突變可通過激酶非依賴性方式觸發內源性 NLRP3 炎癥小體活化，促進 Caspase-1/11 介導的 IL-1β 分泌。該過程與 ROS 增加、線粒體功能異常和花生四烯酸代謝重編程密切相關。

進一步研究表明，RIPK1 可通過 RIPK3 依賴性但 MLKL 非依賴性的方式調控 COX2 活化，促進 PGE2 生成，進而推動 IL-1β 釋放和系統性炎癥。該通路不依賴 RIPK3 激酶活性，而依賴 RIPK1-RIPK3-COX2 復合物形成和 RIPK3 的 RHIM 結構域。

此外，TNFR1 介導的 RIPK3 非依賴性凋亡通路也參與殘余炎癥反應。因此，RIPK1 支架驅動的系統性炎癥主要由兩條路徑共同決定：一是 RIPK1/RIPK3-COX2-PGE2-NLRP3-IL-1β 炎癥軸，二是 TNFR1 介導的凋亡相關炎癥通路。

整體而言，本研究提出了 RIPK1 功能分叉的新模型：
RIPK1 激酶活性主要控制發育階段的細胞死亡，而 RIPK1 支架功能則在成年階段通過代謝重編程和炎癥小體活化驅動系統性炎癥。

這一發現加深了對 RIPK1 在先天免疫、炎癥性疾病和細胞死亡調控中作用的理解，也為開發選擇性靶向 RIPK1 支架功能、同時保留其發育必需作用的新一代治療策略提供了理論基礎。

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